Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune
6 ottobre 2023
Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.
Per studiare i meccanismi molecolari e cellulari nelle malattie autoimmuni come la sclerosi multipla, la generazione di protocolli di isolamento cellulare riproducibili e sofisticati è un'esigenza insoddisfatta. La maggior parte delle attuali tecnologie per isolare e analizzare le cellule residenti nel SNC mostrano gravi carenze, come concentrarsi su un solo tipo di cellula o solo sui topi postnatali. L'attuale protocollo per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel SNC da una replica del SNC offre la possibilità di analizzare reti neuronali complesse e nuove vie infiammatorie, ex vivo da una singola sospensione cellulare, applicabili a topi sani e a quelli con encefalomielite autoimmune sperimentale.
Inoltre, il numero di topi è diminuito Il nostro protocollo per l'isolamento simultaneo di tutti e quattro i principali tipi di cellule residenti nel SNC in topi sani e EAE potrebbe essere utilizzato come strumento utile per i gruppi di ricerca che studiano nuove vie infiammatorie, consentendo un'analisi molto più accurata di meccanismi biomolecolari complessi e reti cellulari ex vivo. Le nuove domande scientifiche a cui si potrebbe rispondere con l'aiuto del nostro protocollo sono le indagini dinamiche nell'EAE durante le diverse fasi del decorso della malattia, come la neuroinfiammazione, la neurodegenerazione e la remissione. Inoltre, le interazioni cellula-cellula e i percorsi biochimici potrebbero essere studiati a livello individuale.
Allo stesso modo, i saggi funzionali potrebbero essere eseguiti con cellule coltivate. Intendiamo concentrarci sugli studi dinamici del corso EAE per l'analisi multi-omica da un singolo omogenato del SNC per punto temporale EAE.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo protocollo per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi cellulari residenti del sistema nervoso centrale (SNC) da un singolo topo, applicabile sia in modelli naïve che in modelli di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo metodo mira a superare i limiti delle attuali tecnologie di isolamento cellulare, consentendo ai ricercatori di studiare le complesse interazioni cellulari durante la neuroinfiammazione riducendo al minimo il numero di topi utilizzati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sull'autoimmunità
Sfondo
- I protocolli esistenti spesso si concentrano su un singolo tipo cellulare o solo su topi postnatali.
- L'isolamento di cellule residenti nel SNC può migliorare significativamente la nostra comprensione dei processi neuroinfiammatori.
- La necessità di un protocollo completo e riproducibile per l'isolamento cellulare è sempre più importante nel contesto delle malattie autoimmuni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'isolamento di tutti i principali tipi cellulari residenti nel SNC da un singolo topo.
- Facilitare l'analisi delle reti cellulari in condizioni di salute e di malattia.
- Permettere studi più accurati delle vie infiammatorie nella neuroinfiammazione.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza un metodo di dissociazione cellulare applicabile sia a topi sani che a topi con EAE.
- I topi vengono posizionati in posizione supina, seguendo un protocollo dettagliato e articolato per fasi per ottenere tessuto cerebrale e del midollo spinale.
- I protocolli di precipitazione, lavaggio e purificazione cellulare sono descritti minuziosamente, garantendo rese elevate di tipi cellulari del sistema nervoso centrale.
Risultati principali
- Il protocollo consente l'isolamento simultaneo di microglia, oligodendrociti e altri tipi cellulari residenti nel SNC per analisi successive.
- Si prevede che questo metodo fornisca informazioni sulle dinamiche cellulari in diverse fasi della EAE.
- Miglioramenti fondamentali includono la riduzione dell'uso di animali e un miglioramento della qualità dei dati ottenuti da preparati del SNC derivati da singoli topi.
Conclusioni
- Questo studio dimostra una nuova tecnica di isolamento cellulare che potenzia le capacità di ricerca in neuroimmunologia.
- La capacità del metodo di analizzare meccanismi biomolecolari complessi partendo da un numero ridotto di campioni ha significative implicazioni per lo studio dei modelli di malattie del sistema nervoso centrale.
- Nel complesso, il protocollo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la neuroinfiammazione e gli interventi terapeutici nelle condizioni autoimmuni.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi cellulari residenti nel SNC da topi adulti con EAE permette un'analisi completa dei meccanismi neuroinfiammatori in un singolo esperimento. Questo approccio consente analisi ad alto contenuto e multiomiche riducendo l'uso di animali, con un impatto diretto sulla scoperta precoce e sulla validazione di bersagli nei portafogli di neuroimmunologia. Il protocollo aumenta la sicurezza predittiva per la riduzione del rischio di percorsi molecolari e lo sviluppo di biomarcatori traslazionali nei modelli di malattie autoimmuni del SNC.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi ex vivo di complesse reti neuronali e gliali da singoli campioni del sistema nervoso centrale.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo un'indagine dinamica delle fasi di neuroinfiammazione, neurodegenerazione e remissione.
- Facilita la validazione funzionale degli bersagli mediante l'isolamento di popolazioni cellulari del sistema nervoso centrale vitali e ad alta purezza.
- Riduce la variabilità biologica ottenendo tutti i tipi cellulari dallo stesso animale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sospensioni cellulari singole con elevata vitalità, validate per saggi funzionali e fenotipici successivi.
- Standardizza l'isolamento cellulare tra i diversi tipi cellulari del sistema nervoso centrale, migliorando la riproducibilità e la confrontabilità dei saggi.
- Consente la preparazione scalabile di cellule residenti nel sistema nervoso centrale per lo screening di composti e l'analisi dei percorsi molecolari.
- Permette valutazioni quantitative della purezza e della vitalità mediante citometria a flusso per determinare la prontezza al saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli EAE pertinenti alle malattie per la scoperta e la validazione di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo analisi della malattia in più stadi.
- Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fornendo dati cellulari completi ottenuti da singoli animali.
- Supporta l'indagine sulle interazioni tra cellule e sui percorsi biochimici rilevanti per l'autoimmunità del sistema nervoso centrale umano.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo analisi simultanee di più tipi cellulari da topi con EAE e topi sani, sostenendo sia la ricerca ipotetica che quella esplorativa.
- Biologia della scoperta: Favorisce la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici consentendo l'analisi dinamica e specifica per stadio delle cellule del sistema nervoso centrale.
- Screening: Fornisce sospensioni cellulari riproducibili e ad alta purezza per lo sviluppo solido di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Fornisce parametri quantitativi di vitalità e purezza mediante citometria a flusso per confronti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica supportando l'allineamento dei biomarcatori in modelli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'isolamento di cellule del sistema nervoso centrale applicabile in diversi programmi di ricerca sulle neuroinfiammazioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle autoimmunità del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento cellulare, migliora la riproducibilità e riduce al minimo l'utilizzo di animali.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale, consentendo analisi multiparametriche a partire da un singolo animale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e lo sviluppo di target e biomarcatori neuroinfiammatori con un'adeguata gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del sistema nervoso centrale, nella dissociazione cellulare e nel sorting cellulare attivato da campo magnetico (MACS).
- Necessita dell'accesso a strumentazione per citometria a flusso e sorting cellulare per il controllo di qualità.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la gestione dei tessuti e i protocolli analitici.
- Adattabile sia a modelli murini adulti sani che a modelli di EAE, garantendo un'ampia applicabilità.
- Dipende da una manipolazione accurata per mantenere la vitalità e la purezza cellulare, come supportato dai dati originali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:58
Preparation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
3:54
Dissociation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
5:25
Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice
7:18
Isolation of CNS Cell Types Using Magnetic Beads in Naive and EAE Mice
