Retina divisa come preparazione flatmount migliorata per lo studio dei neuroni dello strato nucleare interno nella retina dei vertebrati
16 gennaio 2024
Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.
Il nostro gruppo è interessato ai circuiti neuronali e ai meccanismi sinaptici alla base dell'elaborazione visiva nella retina. Il Morgans Lab sta studiando i meccanismi molecolari di adattamento alla luce nelle cellule bipolari e il Sivyer Lab è interessato a come i neuroni retinici interni contribuiscono alla funzione delle cellule ganglionari. L'accesso ai neuroni dello strato internucleare nell'intera retina è una sfida sia per gli studi anatomici che per quelli fisiologici.
I neuroni dello strato internucleare sono accessibili in sezioni verticali, ma sono pochissimi i neuroni nel campo visivo. Inoltre, l'affettatura recide i processi laterali e le connessioni che possono avere un impatto sugli studi fisiologici. La rimozione dei fotorecettori nella tecnica della retina divisa migliora notevolmente la diffusione degli anticorpi nella retina interna, il che rende l'immunomarcatura dei bersagli retinici interni oltre 20 volte più veloce rispetto alla tradizionale retina a montaggio intero.
La retina divisa migliora notevolmente anche l'accesso ai neuroni dello strato internucleare durante l'elettrofisiologia del patch clamp. La tecnica della retina divisa aprirà le porte a nuovi approcci e accelererà il ritmo dei nostri esperimenti. Ad esempio, abbiamo in programma di utilizzare questa tecnica per studiare gli input delle cellule bipolari alle cellule gangliari della melanopsina esprimendo la canalrodopsina nelle cellule bipolari.
Panoramica
Questo studio presenta una nuova preparazione della retina in flatmount che migliora la diffusione degli anticorpi e facilita un migliore accesso ai neuroni retinici interni. La tecnica migliora significativamente l'efficienza degli esperimenti di immunohistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della retina
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Il laboratorio Morgans studia i meccanismi di adattamento alla luce nelle cellule bipolari.
- Il laboratorio Sivyer si concentra sui neuroni della retina interna e sul loro ruolo nella funzione delle cellule gangliari.
- Le tecniche tradizionali di preparazione in whole mount presentano difficoltà nello studio dei neuroni del strato nucleare interno.
- La rimozione dei fotorecettori permette un migliore accesso e riduce il tempo di marcatura con anticorpi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo che permetta un accesso più rapido ai neuroni retinici interni.
- Migliorare l'efficienza degli esperimenti di immunomarcatura e di elettrofisiologia.
- Approfondire l'indagine sugli input delle cellule bipolari nei neuroni gangliari melanopsinici.
Metodi Utilizzati
- È stata utilizzata una tecnica di dissezione retinica ex vivo per preparare la retina in preparato piatto (flatmount).
- Il modello biologico prevedeva la dissezione della retina da occhi di topo, consentendo l'accesso ai neuroni dello strato nucleare interno.
- Sono state impiegate tecniche di immunofluorescenza ed elettrofisiologiche per l'analisi.
- I passaggi critici includevano una dissezione accurata, lavaggi in PBS e il trasferimento in mezzo Ames carbogenato.
- La diffusione dell'anticorpo è stata valutata dopo un'incubazione di un'ora.
Risultati principali
- La nuova tecnica ha determinato una diffusione degli anticorpi superiore a 20 volte rispetto ai metodi convenzionali.
- L'integrità sinaptica dei fotoricettori è stata mantenuta durante il processo di preparazione.
- È stata osservata una variabilità regionale nella vitalità cellulare dopo la suddivisione, con la maggior parte delle cellule retiniche che sono rimaste vitali.
- I risultati di immunofluorescenza hanno confermato il mantenimento dei terminali sinaptici dei fotoricettori.
Conclusioni
- Questo metodo consente un accesso più agevole ai neuroni retinici interni per diverse approcci sperimentali.
- Migliora la velocità e l'efficienza degli studi di immunomarcatura e di fisiologia.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per ulteriori indagini sui meccanismi neuronali nella retina.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'accesso efficiente ai neuroni del livello nucleare interno è fondamentale per ridurre i rischi associati a target oftalmologici in fase iniziale e per validare ipotesi meccanicistiche nella scoperta di farmaci retinici. La preparazione di flatmount retinico diviso accelera l'immunomarcatura quantitativa e l'analisi elettrofisiologica, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nell'analisi dei percorsi neuronali. Questa capacità migliora il triage del portafoglio e orienta la continuità traslazionale nei programmi di ricerca sulla visione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della circuitazione delle cellule bipolari e orizzontali per la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio preservando le connessioni neuronali laterali.
- Facilita test rapidi di ipotesi sui meccanismi sinaptici rilevanti per l'elaborazione visiva.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce un sistema biologico validato per immunomarcature ad alto rendimento e test di patch-clamp.
- Migliora la riproducibilità dei test mantenendo l'integrità sinaptica e la vitalità cellulare.
- Fornisce output quantitativi per lo screening degli effetti dei composti sui neuroni della retina interna.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie nello studio della circuitazione retinica implicata nei disturbi della visione.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica supportando molteplici modalità analitiche.
- Riduce il rischio di risultati artefatti preservando la connettività fisiologica nel modello di tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa preparazione collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo analisi funzionali e molecolari solide dei neuroni della retina interna.
- Biologia della scoperta: Accelera la verifica delle ipotesi sui percorsi neuronali e sui meccanismi sinaptici.
- Screening: Consente immunomarcature rapide e riproducibili e letture elettrofisiologiche.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative della diffusione degli anticorpi e della vitalità cellulare per studi comparativi.
- Ricerca traslazionale: Mantiene circuiti rilevanti per la malattia per studi su biomarcatori e meccanismi.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per diverse applicazioni di ricerca e screening retinico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi retinici.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione per flussi di lavoro riproducibili e scalabili tra diversi team.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di avanzamento o interruzione e un progresso capitalisticamente efficiente delle risorse nella ricerca sulla visione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di obiettivi retinici e modalità terapeutiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione della retina e nella manipolazione dei tessuti per ottenere risultati ottimali.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per elettrofisiologia e immunofluorescenza.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità negli studi multicentrici.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie o modelli di malattia.
- La variabilità regionale nella vitalità cellulare deve essere monitorata durante l'implementazione.
