Isolamento, espansione e differenziazione dei progenitori fibro-adipogenici dal modello murino spinoso
15 novembre 2024
Questo protocollo delinea l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) scheletrici e cardiaci da topi spinosi (Acomys) tramite dissociazione enzimatica e smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I FAP ottenuti da questo protocollo possono essere efficacemente espansi e differenziati a miofibroblasti e adipociti.
La nostra visione generale è quella di comprendere e comprendere meglio la comunicazione cellulare e il comportamento cellulare che portano alla metastasi tissutale e come i processi cellulari siano mal regolati nella riparazione dell'alimentazione. Per fare ciò, stiamo utilizzando vari modelli di cui uno è il topo spinoso. Uno dei problemi principali di questo nuovo modello murino è la mancanza di strumenti per studiarlo.
Qui forniamo un nuovo protocollo, che contiene una digestione enzimatica affidabile e la colorazione degli anticorpi. Questo ci permette di selezionare con successo i progenitori fibro-adipogenici e di coltivarli in vitro per un'ulteriore analisi del loro destino. Abbiamo testato varie combinazioni e concentrazioni di enzimi, nonché più anticorpi, e il nostro metodo fornisce riferimenti per il protocollo più affidabile e robusto.
Poiché ora disponiamo di una digestione enzimatica affidabile, continueremo a testare altri marcatori e anticorpi per analizzare con successo le cellule endoteliali, i periciti, le cellule immunitarie e le cellule miogeniche.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) del muscolo scheletrico e cardiaco da topi spinosi (Acomys) mediante dissociazione enzimatica e sorting cellulare attivato da fluorescenza. Il metodo fornisce una digestione enzimatica affidabile e una marcatura con anticorpi per lo sorting efficace e la coltura in vitro dei FAP.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Medicina rigenerativa
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Comprendere la comunicazione e il comportamento cellulare è fondamentale per l'omeostasi dei tessuti.
- I progenitori fibro-adipogenici svolgono un ruolo significativo nella riparazione dei tessuti.
- Il modello del topo spinoso presenta sfide uniche a causa degli strumenti di ricerca limitati.
- Sono necessari protocolli affidabili per lo studio dei FAP in questo modello.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo robusto per l'isolamento di FAP da topi spinosi.
- Permettere ulteriori analisi sulla differenziazione delle FAP in miofibroblasti e adipociti.
- Fornire una base per lo studio di altri tipi cellulari nel modello del topo spinoso.
Metodi Utilizzati
- Dissociazione enzimatica del tessuto muscolare.
- Ordinamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per l'isolamento di FAP.
- Test di diverse combinazioni e concentrazioni di enzimi.
- Utilizzo di diversi anticorpi per un ordinamento efficace.
Risultati principali
- Isolamento ed espansione con successo di FAP da topi spinosi.
- Le FAP possono differenziarsi in miofibroblasti e adipociti.
- Stabilimento di un protocollo affidabile di digestione enzimatica.
- Riferimenti forniti per metodi robusti di colorazione con anticorpi.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora lo studio delle FAP nei topi spinosi.
- Studi futuri potranno esplorare marcatori e tipi cellulari aggiuntivi.
- Questo lavoro contribuisce alla comprensione dei meccanismi di riparazione dei tessuti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e l'amplificazione ottimizzati dei progenitori fibro-adipogenici (FAPs) dal modello del topo spinoso colmano una lacuna fondamentale nella ricerca sulla medicina rigenerativa, consentendo lo studio approfondito dei meccanismi di riparazione tissutale. Questa capacità sostiene le attività iniziali di scoperta incentrate sulla comunicazione cellulare, sul rimodellamento della matrice extracellulare e sulla biologia rigenerativa comparativa. Il protocollo migliora la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione dei rischi meccanicistici nello sviluppo di modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei percorsi rigenerativi e delle interazioni cellulari in un modello mammifero altamente rigenerativo.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio isolando ed espandendo le FAP per studi meccanicistici successivi.
- Facilita la riduzione del rischio biologico fornendo una piattaforma per confrontare le risposte rigenerative del topo spinoso e di Mus musculus.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce popolazioni cellulari validate per saggi in vitro standardizzati di differenziazione e rimodellamento della matrice.
- Migliora la riproducibilità dei saggi attraverso protocolli robusti di digestione enzimatica e di separazione cellulare basati su anticorpi.
- Consente una valutazione quantitativa delle decisioni del destino delle FAP in condizioni definite.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando la riparazione del tessuto e la fibrosi in un contesto mammifero.
- Supporta la scoperta di biomarcatori traslazionali permettendo studi comparativi dei meccanismi rigenerativi.
- Consolida le decisioni di avanzamento corrette per il rischio nei portafogli di medicina rigenerativa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un metodo affidabile per l'isolamento e l'espansione delle FAP per studi meccanicistici, di screening e traslazionali.
- Biologia della scoperta: Permette l'avanzamento dei test di ipotesi sul destino cellulare e sul rimodellamento della matrice in contesti rigenerativi.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili e ben caratterizzate per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Consente la misurazione quantitativa degli esiti di differenziazione e della purezza delle popolazioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: Favorisce il confronto interspecifico dei processi rigenerativi e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per l'isolamento di ulteriori tipi cellulari dal modello del topo spinoso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi rigenerativi e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per l'isolamento e l'amplificazione cellulare al fine di garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione riducendo l'ambiguità biologica nella ricerca delle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei programmi di medicina rigenerativa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in citometria a flusso, dissociazione enzimatica dei tessuti e coltura cellulare.
- Richiede l'accesso a strumentazione FACS e pannelli di anticorpi validati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di digestione e colorazione per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per altri tipi di tessuto o specie man mano che la ricerca si espande.
- Dipende da un'ottimizzazione continua per ulteriori marcatori cellulari e popolazioni.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Collection of Skeletal and Cardiac Muscles from Spiny Mouse for Isolating Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
2:46
Digestion of Mouse Skeletal and Cardiac Muscles for Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
5:01
Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
