Miglioramento della consegna e dell'espressione genica mediante iniezione intraossea di plasmidi editor di base adenina incapsulati con nanoparticelle di chitosano

Proponiamo un metodo di terapia genica che rilascia direttamente l'Editor Chitosano a base di adenina nel midollo osseo attraverso l'iniezione intraossea. L'efficienza di trasfezione dei plasmidi esogeni negli animali da esperimento è relativamente bassa e l'introduzione di plasmidi per l'espressione genica a lungo termine può essere influenzata dal sistema immunitario. Usiamo il chitosano per incapsulare plasmidi editor a base di adenina e abbiamo consegnato direttamente il complesso al midollo osseo dei topi attraverso iniezione intraossea, rendendolo adatto per malattie causate da una funzione anomala degli osteoclasti.

Il nostro protocollo offre un'elevata efficienza di trasfezione, un piccolo danno biologico e un'elevata efficienza di espressione genica. La nostra nuova strategia non è adatta solo per le malattie causate da una funzione anomala degli osteoclasti, ma ha anche un potenziale significativo per far progredire il campo della terapia genica. Per iniziare, posiziona un topo soppresso su un tavolo da lavoro.

Usando forbici e pinzette chirurgiche, rimuovi la tibia e rimuovi tutto il tessuto muscolare circostante. Immergere la tibia pulita in PBS e lavare fino a quando non rimane solo l'osso. Aspirare un millilitro di PBS in una siringa e sciacquare le cellule del midollo osseo da un'estremità della tibia fino a quando l'osso diventa completamente bianco.

Quindi, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta. Centrifugare a 800 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver pipettato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi al pellet.

Dopo un minuto, aggiungere un millilitro di tampone di separazione per terminare la lisi. Centrifugare nuovamente la sospensione a 800 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e mettere il pellet di cellule risultante sul ghiaccio per un uso successivo.

Per la trasfezione del chitosano, sciogliere quattro milligrammi di chitosano in 20 millilitri di soluzione di acido acetico. Regolare il pH a 5,5 utilizzando 10 molari di idrossido di sodio. Quindi erogare 500 microlitri della soluzione di chitosano in singole provette da microcentrifuga.

Ora aggiungi due, tre, quattro e cinque microgrammi di plasmidi ABE in singole provette. Sciogliere i plasmidi in 500 microlitri di solfato di sodio da 30 millimolari. Quindi mescolare 500 microlitri di soluzione plasmidica con 500 microlitri di soluzione di chitosano nelle provette corrispondenti.

Incubare le provette a bagnomaria a 50-55 gradi Celsius per 15 minuti. Agitare ogni tubo per 15-30 secondi e lasciarli riposare indisturbati per 30 minuti. Per la caratterizzazione, analizzare il diametro e il potenziale zeta del chitosano utilizzando la diffusione dinamica della luce.

Mantenere la concentrazione di chitosano a 0,1 milligrammi per millilitro in acqua distillata doppia. Quindi, gettare 0,1 milligrammi per millilitro di campioni di chitosano su un chip di silicio. Aggiungere 20 microlitri di campioni risospesi su 200 griglie a maglie e incubare.

Centrifugare la sospensione di cellule del midollo osseo a 800 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante, quindi aggiungere 500 microlitri di lisato di globuli rossi. Dopo un minuto, aggiungere un millilitro di tampone di separazione per fermare la reazione.

Quindi contare il numero di celle con un contatore di celle. Quindi, trasferire 1 milione di cellule in una nuova provetta per microcentrifuga. Dopo aver centrifugato nuovamente, pipettare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS.

Trasferire le cellule risospese in una provetta per citometria a flusso e misurare l'efficienza di trasfezione utilizzando la citometria a flusso. Per l'iniezione della cavità del midollo osseo, fissare il topo anestetizzato in posizione supina sul tavolo operatorio. Utilizzare del nastro adesivo per fissare l'arto anteriore in posizione.

Disinfettare la tibia posteriore con un tampone imbevuto di alcol. Quindi caricare la soluzione plasmidica in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26. Rimuovere eventuali bolle d'aria e tenere la siringa pronta per l'iniezione.

Quindi, tocca e stabilizza lo stinco del mouse con le dita. Posizionare l'ago per iniezione in modo che entri nell'asta tibiale dal piatto tibiale vicino all'articolazione del ginocchio. Ora ruotare l'ago parallelamente alla tibia, inserirlo nella cavità del midollo osseo e iniettare lentamente nell'arco di tre secondi.

Dopo l'iniezione, estrarre lentamente l'ago nell'arco di tre secondi. Disinfettare immediatamente il sito di puntura utilizzando un tampone imbevuto di alcol per fermare qualsiasi sanguinamento. Posiziona il mouse in un ambiente caldo a 37 gradi Celsius per facilitarne il recupero.

Le nanoparticelle formate con i plasmidi ABE e GRNA avevano una morfologia sferica uniforme e una distribuzione dimensionale ristretta con una dimensione media di 202,9 nanometri. Un potenziale zeta di 2,77 millivolt e un indice di polidispersione di 0,22. Il plasmide ABE incorporato nel chitosano ha migliorato significativamente il segnale fluorescente nelle cellule del midollo osseo, indicando una maggiore efficienza di trasfezione rispetto al gruppo di controllo.

La citometria a flusso ha confermato che il plasmide ABE codificato con chitosano ha raggiunto un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule del midollo osseo. Con l'efficienza di picco del 51,2% osservata a una dose di quattro microgrammi, mentre tre microgrammi hanno fornito un equilibrio di alta efficienza del 47,2%, il sequenziamento Sanger e la PCR del DNA genomico delle cellule del midollo osseo hanno rivelato l'editing genico in vivo nel sito target A1 con un'efficienza del 14,27% e nel sito A2 con un'efficienza del 10,69%.