Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

La nostra ricerca esplora il modo in cui le microglia influenzano la riparazione cerebrale dopo una lesione cerebrale prenatale. E miriamo a determinare se la modulazione dell'attività delle cellule microgliali può migliorare gli esiti neurologici a lungo termine. Credo che sia la complessità delle risposte delle cellule microgliali e le sfide di descrivere tali risposte nel modo più accurato per rappresentare le risposte fisiologiche, ma anche patologiche e le malattie.

Stiamo utilizzando diverse modalità, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e gli esperimenti di citometria a flusso, per caratterizzare gli stati e la funzione microgliale nel cervello in via di sviluppo dopo un danno prenatale. Una delle principali sfide è preservare la vitalità cellulare e l'identità microgliale durante l'isolamento, specialmente nei momenti neonatali quando il numero di cellule cerebellari è limitato. Solleva interrogativi su come gli insulti cerebellari nei primi anni di vita portino ad alterazioni trascrizionali nella sottopopolazione microgliale e su come le terapie mirate possano modulare questi cambiamenti.

Per iniziare, seziona la regione specifica del cervello dei topi secondo necessità. Usando una pinza, trasferire il tessuto in una piccola capsula di Petri contenente terreno di coltura cellulare microgliale posto su ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. Utilizzando una pipetta, rimuovere il terreno di coltura cellulare microgliale dalla piastra di Petri.

Quindi, usando un bisturi, taglia finemente il tessuto cerebrale nella stessa capsula di Petri. Trasferire il tessuto cerebrale omogeneizzato in provette da cinque millilitri per la digestione enzimatica. Aggiungere due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks integrata con collagenasi D e DNasi 1 a ciascuna provetta e sigillare ermeticamente i tappi con Parafilm.

Quindi, incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, agitandole ogni cinque minuti. Per fermare la digestione, posizionare i tubi sul ghiaccio. Quindi, passare l'omogeneizzato attraverso un filtro a rete metallica da 140 micrometri per rimuovere i detriti di grandi dimensioni.

Utilizzando un pestello di vetro, dissociare delicatamente le celle rimanenti sul filtro. Lavare più volte il filtro a rete metallica con tre millilitri di terreno di coltura cellulare microgliale per ogni lavaggio. Ora, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere il filtrato e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.

Quindi, centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, capovolgere con cura il tubo per scartare il surnatante. Utilizzando una griglia, raschiare delicatamente il tubo per risospendere il pellet.

Quindi, aggiungere 10 millilitri di una soluzione di terreno colloidale a base di silice al 37% alle cellule risospese. Centrifugare la soluzione a 500 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con una forza di rottura minima. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, aspirare lo strato di mielina dalla parte superiore della soluzione.

Per lavare le cellule, aggiungere 10 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks e centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante e risospeso il pellet, aggiungere 10 millilitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza nella provetta. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet finale nel tampone rimanente per le applicazioni a valle.

Trasferire tutte le celle isolate in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico. Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Capovolgere rapidamente la piastra con un solo movimento per scartare il surnatante.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in 25 microlitri di soluzione bloccante e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Per preparare la miscela di colorazione extracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere gli aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante.

Utilizzando il tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza, regolare il volume totale a 25 microlitri. Ora, aggiungi 25 microlitri della miscela di colorazione anticorpale extracellulare a ciascun pozzetto e incuba la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza in ciascun pozzetto.

Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere rapidamente la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza e centrifugare come dimostrato in precedenza.

Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone saponina-paraformaldeide per fissare e permealizzare le cellule. Quindi, incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Senza mescolare, aggiungere 100 microlitri di tampone saponinico in ogni pozzetto.

Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone saponina. Successivamente, preparare i controlli di compensazione aggiungendo 20 microlitri di perle a 11 pozzetti vuoti.

Per preparare la miscela di colorazione intracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere potenziali aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante. Regolare il volume a 50 microlitri utilizzando il tampone saponina.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di miscela di anticorpi intracellulari. Aggiungere un microlitro di ciascun anticorpo ai rispettivi pozzetti delle microsfere e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone saponina a ciascun pozzetto contenente campioni di cellule.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza a ciascun pozzetto di controllo di compensazione per lavare le perle. Una volta centrifugata la piastra, risospendere il pellet cellulare e controllare rispettivamente 200 microlitri di tampone saponina e tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza. Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.

Risospendere sia i campioni cellulari che i controlli di compensazione in 200 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Trasferire le sospensioni in provette di smistamento cellulare attivate con fluorescenza marcate. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha identificato un cluster microgliale distinto separato da altri tipi di cellule cerebrali in base ai profili trascrizionali.

L'analisi dell'espressione differenziale ha rivelato geni significativamente sovraregolati nelle microglia, tra cui Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 e P2ry12. Le cellule microgliali sono state isolate con successo da campioni di cervello vivo in base alla loro distinta espressione dei marcatori CD45 e CD11b. Sono state identificate sottopopolazioni microgliali distinte sulla base di combinazioni di marcatori di attivazione, tra cui CD80, CD86, iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 e CD163 con CD206.

L'espressione genica marcatore di Ptprc e Itgam è stata localizzata specificamente nel cluster microgliale nella proiezione umap, confermando l'identità di queste cellule. L'analisi del diagramma di violino ha mostrato una minore espressione di marcatori antinfiammatori, come Fcgr1 e Cd86, nelle microglia trattate rispetto al controllo del veicolo.