Quantificazione della violaceina nel Chromobacterium violaceum e sua inibizione da parte di composti bioattivi

La nostra ricerca mira a identificare i composti che inibiscono il quorum sensing, che regola i fenotipi chiave. Questo protocollo esamina le molecole che riducono la produzione di violaceina senza influenzare la crescita batterica, suggerendo un'interferenza di quorum sensing. Studi recenti hanno identificato nuovi composti bioattivi che inibiscono il quorum sensing senza influenzare la crescita batterica, rafforzando il loro potenziale come agenti anti-virulenza contro i batteri resistenti agli antibiotici.

Le sfide principali includono la specificità dell'inibizione del quorum sensing, poiché i composti possono influenzare la crescita o i tratti. In questo protocollo, chiamato deferenza e solubilità, il bilanciamento dell'impatto, la quantificazione richiede un'attenta manipolazione. Abbiamo stabilito un protocollo utilizzato in composti bioattivi a concentrazioni sub-inibitorie che non influenzano la crescita batterica.

Questa è una premessa chiave per iniziare la segnalazione del quorum sensing diversa dalla ricerca antimicrobica. Ci concentreremo sull'identificazione di nuovi inibitori dello stato quorum e sui meccanismi di inibizione della comunicazione, specialmente nei batteri rilevanti per l'alimentazione e la salute. Per iniziare, coltiva una coltura da cinque millilitri di cromobacterium violaceum ATCC 12472 in Luria Bertani o brodo LB.

Incubare la coltura a 30 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante impostata a 220 giri al minuto per 24 ore. Misurare la densità ottica della coltura notturna e regolarla a circa una volta 10 alla potenza di otto unità formanti colonie per millilitro. Usando il brodo LB.

Per la preparazione del composto, pesare il composto bioattivo e diluirlo in DMSO puro o in una miscela uno a uno di DMSO e acqua, a seconda della solubilità. Prendi una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e aggiungi il brodo LB insieme al composto bioattivo secondo uno schema di diluizione seriale. Per calcolare il volume richiesto di soluzione madre per la concentrazione desiderata in ciascun pozzetto, applicare la formula.

Nella prima colonna di ogni set di diluizione dei cereali. Aggiungere 196 microlitri di brodo Luria Bertani alle colonne tre, cinque e sette. Quindi, nelle successive colonne utilizzate per la diluizione, aggiungere 100 microlitri di brodo Luria Bertani alle colonne quattro, sei e otto.

Per avviare la diluizione seriale, aggiungere quattro microlitri del composto bioattivo al primo pozzetto di ciascun set, che corrisponde alle colonne tre, cinque e sette. Dopo la miscelazione, trasferire 100 microlitri da ciascun pozzetto alla colonna adiacente. Per continuare la diluizione seriale raggiungendo le colonne quattro, sei e otto.

Ripetere l'intera procedura in triplicato per ogni concentrazione di ogni composto utilizzando punte fresche per evitare la contaminazione incrociata. Aggiungere 80 microlitri di brodo Luria Bertani alle file da B a D in tutti i pozzetti. Portando il totale a 180 microlitri per pozzetto.

Quindi aggiungere 20 microlitri della coltura standardizzata di cromobacterium violaceum dalla preparazione precedente a ciascuno di quei pozzetti, raggiungendo un volume finale di 200 microlitri. In base alla compatibilità dello spettrofotometro. Coprire la micropiastra con un coperchio o una pellicola sigillante per evitare l'evaporazione.

Incubare la piastra sigillata a 30 gradi Celsius con agitazione a 130 giri al minuto per 24 ore. Dopo l'incubazione, trasferire la piastra in un'incubatrice di essiccazione impostata a 60 gradi Celsius. Togliete il coperchio e lasciatelo asciugare completamente per circa otto ore.

Una volta asciutta, rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 200 microlitri di DMSO puro a ciascun pozzetto. Coprire la piastra e incubarla a 25 gradi Celsius agitandola a 130 giri al minuto per 30 minuti per sciogliere il pigmento violaceina. Dopo l'incubazione, trasferire con cura 100 microlitri della soluzione di violaceina disciolta in una nuova micropiastra.

Evitare il contatto tra il puntale della pipetta e le pareti del pozzetto. Misurare l'assorbanza della violaceina a 595 nanometri in uno spettrofotometro per micropiastre con il coperchio per evitare contaminazioni. Agitare per cinque secondi prima di ogni lettura ed eseguire la lettura con il coperchio per evitare contaminazioni.

Per calcolare la produzione di violaceina, sottrarre prima l'assorbanza del bianco da ciascun campione per escludere l'interferenza di fondo, quindi calcolare la percentuale di violaceina utilizzando il controllo non trattato come riferimento con l'equazione. Tre composti bioattivi, resveratrolo, farnesolo e linalolo sono stati testati per la loro capacità di inibire la produzione di violaceina nel cromobatterio violaceo ATCC 12472. Il farnesolo ha ridotto significativamente la produzione di violaceina al 9% a 200 microgrammi per millilitro e al 19% a 100 microgrammi per millilitro, rispetto al 100% nel controllo non trattato.

Il trattamento con linalolo sia a 200 che a 100 microgrammi per millilitro ha portato a una produzione di violaceina del 32%, mostrando un'inibizione del 68% rispetto al controllo. Il resveratrolo a 25 microgrammi per millilitro, ha ridotto la produzione di violaceina al 15%, mentre a 12 microgrammi per millilitro, ha raggiunto il 30% rispetto al 100% nel controllo non trattato. Le immagini delle micropiastre hanno confermato visivamente una riduzione della pigmentazione della violaceina per tutti i trattamenti rispetto al controllo non trattato.