Un flusso di lavoro pratico per l'analisi dei dati di transcriptomica spaziale: dall'acquisizione dei dati alle analisi avanzate

Ciao a tutti. In questo video, illustreremo una pipeline pratica per l'analisi di dati di transcriptomica spaziale, partendo dall'acquisizione e dal caricamento dei dati, passando per un'analisi di base, fino ad arrivare all'analisi avanzata. Nel complesso, il flusso di lavoro comprende tre passaggi principali.

Prima, scaricare i dati; secondo, ottenere il codice di analisi; terzo, eseguire la pipeline per generare i risultati. Passo uno, acquisizione dei dati e preparazione della struttura delle directory. Per prima cosa, ottenere set di dati pubblici di trascrittomica spaziale.

Scaricare l'archivio dei dati grezzi ed estrarre l'archivio. Organizzare i file in una struttura di directory standardizzata.

Per prima cosa, creare una directory principale per i dati, quindi creare una sottodirectory dedicata per ciascun campione. Trasferire i seguenti file essenziali per ciascun campione nella rispettiva sottodirectory. Successivamente, creare una sottocartella spaziale all'interno della directory di ogni campione.

Collocare i seguenti file nella sottocartella spatial. Inserire il file S1 delle metriche PC delle caratteristiche filtrate nella sottodirectory principale del campione. Decomprimere i file gzip nella cartella spatial.

Assicurarsi che i nomi originali dei file rimangano esattamente come richiesti dalla funzione di caricamento 10X spatial. Secondo passaggio, configurazione dell'ambiente software. In questo caso si omette l'installazione del linguaggio R e il flusso di dati inizia ottenendo lo script di analisi nel repository GitHub.

Installare i pacchetti R richiesti da Graham nel file conductor eseguendo lo script setup R. Installare auto suit eseguendo i comandi di installazione forniti nel foglio del documento ufficiale. Accedere all'URL ufficiale di installazione per recuperare gli script di configurazione. Inizializzare l'ambiente Python richiesto e le dipendenze di sistema secondo le istruzioni riportate nella pagina di configurazione.

Acquisire lo strumento personalizzato accedendo al repository GitHub e scaricare il codice sorgente. Accedere alla directory TOS e installare le dipendenze Python. Passo tre: caricamento dei dati spaziali e controllo di qualità.

Leggere i dati spaziali in un oggetto Seurat. Utilizzare la funzione di lettura dell'immagine 10X per caricare manualmente l'immagine tissutale ad alta risoluzione. Specificare lì l'immagine e il nome dell'immagine.

Utilizzare il carico 10X spatial con il parametro immagine impostato sull'oggetto immagine creato nel passaggio precedente e creare l'oggetto Seurat. Calcolare le metriche di controllo qualità. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali utilizzando l'insieme di funzionalità percentuale con il modello mt.

Visualizzare e interpretare i dati in base alle metriche di controllo qualità (QC). Generare grafici a violino di nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent. mt utilizzando la funzione per grafici a violino.

Crea grafici delle caratteristiche spaziali di queste metriche utilizzando grafici delle caratteristiche spaziali. E identifica i punti al di fuori dell'area del tessuto. Facoltativo: applica filtri per rimuovere i punti di bassa qualità.

Dopo l'esecuzione dello script, è possibile ottenere questi risultati, inclusi i parametri di controllo qualità (QC) e il grafico spaziale delle caratteristiche. Passaggio quattro: pre-elaborazione dei dati, integrazione e raggruppamento. Normalizzare durante la pre-elaborazione dei singoli campioni.

Applicare una normalizzazione SC transform separatamente a ciascun campione con il test Spatial. Integrare più campioni. Preparare l'elenco degli oggetti normalizzati con SCTransform per l'integrazione.

Assicurarsi che ogni oggetto disponga di un saggio RNA copiando il saggio spaziale. Utilizzare le funzionalità di integrazione selezionate nell'integrazione PREP SCT per identificare le caratteristiche variabili condivise. Individuare gli ancoraggi di integrazione mediante la funzione trova ancoraggi di integrazione con il metodo di normalizzazione SCT.

Integrare i dati utilizzando IntegrateData. Eseguire la riduzione della dimensionalità nel clustering sul saggio integrato. Eseguire l'analisi PCA sui dati integrati utilizzando runPCA.

Determinare il numero ottimale di componenti principali per l'analisi successiva calcolando la varianza cumulativa spiegata. Identificare il punto del gomito mediante analisi del programma. Eseguire UMap utilizzando il numero determinato di CP.

Raggruppare le cellule utilizzando FindNeighbors e FindClusters. Specificare i PC determinati nell'impostazione di risoluzione 0,5. Eseguire l'analisi di espressione differenziale tra i gruppi di interesse utilizzando la funzione FindWorkers.

Identificare i geni variabili nello spazio. Per ogni campione originale, eseguire la ricerca di caratteristiche variabili nello spazio utilizzando il metodo di Moran's I sull'assay SCT per calcolare l'autocorrezione spaziale. Dopo aver eseguito questo script, è possibile ottenere il grafico del gomito, il grafico UMap, il grafico dei cluster, la mappa termica dei marcatori dei cluster, il diagramma a volano, i geni differenzialmente espressi per caratteristica spaziale, i geni spazialmente affidabili e i marcatori dei livelli del colon.

E il grafico a punti dei marcatori del colon, insieme ai marcatori nel grafico delle caratteristiche spaziali. Passo cinque, pre-elaborazione dei dati di riferimento a singola cellula. Leggere la matrice di conteggio dell'RNA-seq a singola cellula utilizzando read 10X e creare un oggetto Seurat.

Eseguire la normalizzazione QC standard e la rimozione dei cluster. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali nelle cellule filtrate. Normalizzare i dati utilizzando la trasformazione SC.

Impostare una vara.to. per eseguire una regressione della percentuale.mt. Eseguire PCA e UMap e raggruppare le cellule utilizzando il metodo di selezione dinamica dei PC descritto nei passaggi precedenti, quindi annotare i tipi cellulari.

Calcola i punteggi dei moduli per i geni marcatore dei tipi cellulari canonici utilizzando AddModuleScore. Annota i cluster in base ai punteggi dei moduli e alla biologia nota. In alternativa, importa annotazioni pre-calcolate dai metadati.

Dopo aver appreso questo script, è possibile ottenere le metriche di controllo qualità. Sono stati caricati l'UMap per cluster, l'UMap per campione e i punteggi dei tipi cellulari. Passo sei: deconvoluzione guidata da riferimento con SPOTlight.

Preparare innanzitutto i dati per SPOTlight. Convertire l'oggetto Seurat di singola cellula annotato e l'oggetto Seurat spaziale in un oggetto di esperimento di singola cellula. Effettuare la normalizzazione logaritmica dei dati di singola cellula utilizzando LogMoreCounts.

Eseguire quindi la deconvoluzione SPOTlight. Per prima cosa, identificare i geni ad alta variabilità nei dati single-cell utilizzando ModelGeneVar. Calcolare i marcatori dei tipi cellulari utilizzando score markers e filtrare i marcatori di alta qualità.

Ridurre il numero di cellule di riferimento monocellulare per ogni tipo cellulare a una quantità gestibile al fine di diminuire il tempo computazionale. Eseguire la deconvoluzione utilizzando la funzione SPOTlight, fornendo il riferimento monocellulare, i dati spaziali, l'elenco dei marcatori e i geni altamente variabili (HVGs), quindi visualizzare ed esportare i risultati. È possibile ottenere il risultato della deconvoluzione in questo modo, mostrato come un diagramma a dispersione.

Passaggio sette, deconvoluzione non supervisionata con Stdeconvolve. Per prima cosa, preparare i dati spaziali. Estrarre le metriche del conteggio delle righe dall'oggetto spaziale Seurat utilizzando GetAssayData con lo slot counts.

Rimuovere i punti e i geni di bassa qualità utilizzando i conteggi puliti di STdeconvolve. Identificare i tipi cellulari latenti per i filtri che comprendono quattro geni espressi in una frazione minima di punti, utilizzando LDA rigoroso limitato mediante raggiungimento di tale modello di allocazione su un intervallo di numeri di argomenti potenziali tramite fitLDA. Selezionare il modello ottimale in base alla complessità minima utilizzando il modello ottimale con opt min.

Analizzare e visualizzare i risultati. Estrarre la proporzione di sierotipo, Theta, e i profili genici Beta per il modello ottimale utilizzando getBetaTheta. Per aggiungere l'interpretazione biologica degli argomenti di corrosione, importare le annotazioni delle regioni di interesse generate dallo strumento di selezione delle posizioni spaziali.

Utilizzare queste annotazioni come parametro del gruppo nella funzione con tutti gli argomenti. Al progetto, riportare le proporzioni dei tipi cellulari deconvolute sulle coordinate spaziali e codificare a colori i punti in base alla loro area di interesse (ROI). Dopo aver eseguito lo script, si otterrà un risultato di questo tipo, un carico di tubo su scala, simile a quelli prodotti da SPOTlight.

Passaggio otto, comunicazione spaziale tra cellule utilizzando Giotto. In primo luogo, convertire l'oggetto Seurat in un oggetto Giotto. Utilizzare la funzione createGiottoObject, fornendo le metriche a basso conteggio e le coordinate spaziali.

Preelaborare l'oggetto Giotto e aggiungere il risultato della deconvoluzione. Normalizzare i dati utilizzando Giotto normalizzato, aggiungendoli come annotazioni di sierotipo. Scegliere i metadati cellulari utilizzando addCellmetadata.

Crea una rete spaziale utilizzando createSpatialNetwork. Carica un database di recettori ligandi nel nostro ambiente. Esegui explore CellCellcom per identificare interazioni significative tra ligandi e recettori tra tipi cellulari che sono in prossimità spaziale.

È possibile ottenere il grafico a punti della comunicazione tra cellule in questo modo. Il passaggio nove è facoltativo. Selezione interattiva dei punti con SelectSpatialSpot.

Preparare i dati per lo strumento interattivo utilizzando lo script six. Estrarre le coordinate spaziali dall'oggetto Seurat utilizzando GetTissueCoordinates. Formattare ed esportare i dati.

Esportare il frame di dati formativo in un file CSV. Quindi eseguire l'analisi della regione di interesse. Avviare il personalizzato.

Selezionare le applicazioni punti spaziali e caricare il file CSV. Selezionare interattivamente i punti in base alla posizione spaziale. Quindi esportare l'elenco dei punti selezionati e del loro gruppo assegnato, etichettato come un nuovo file CSV.

Controlliamo semplicemente cosa possiamo ottenere eseguendo lo script uno alla volta. Tutti i risultati vengono salvati nella cartella risultati suddivisa in cinque parti. E come potete vedere, possiamo ottenere le metriche di controllo qualità e dividerle.

E puoi verificare il grafico delle caratteristiche spaziali qui. Inoltre, il processo di deconvoluzione è stato eseguito sia in modo supervisionato che non supervisionato. I risultati di SPOTlight sono qui.

Come si può vedere, tutti i punti contengono l'informazione sulle proporzioni. Qui vengono inoltre generati i risultati della deconvoluzione non supervisionata ottenuti con STdeconvolve. E questo è il risultato dei cluster di Seurat per il punto nei dati spaziali.

È inoltre possibile visualizzarli nel grafico spaziale dei team, come questo. Inoltre, è possibile ottenere il risultato della comunicazione tra spot mediante Giotto. Questo intero flusso di lavoro è al 100% open source.

Analisi di spotting dalle metriche di espressione alla modellizzazione spaziale avanzata. Tutti i passaggi vengono eseguiti su una macchina con 16 GB di RAM. La base del codice è modulare, un singolo script per ogni attività.

Si noti che questa pipeline non copre l'elaborazione preliminare a partire dal prezzo FASTQ. L'attenzione è focalizzata sui dati spaziali 2D e attualmente include soltanto i downloader di Visium. È tutto, grazie per aver guardato.