Costruzione e l'impianto di un sistema Microinfusion sostenuta per l'erogazione degli agenti neuroattivi.

Ciao, mi chiamo Miles Cunningham. Insieme a Ryan O'Connor e Sydney Wong, illustreremo la costruzione di un sistema di microinfusione per la somministrazione continua di agenti neuroattivi. Questo lavoro è stato svolto nel laboratorio di neuro-ricostruzione presso il McLean Hospital della Harvard Medical School.

Vorremmo ringraziare la Sydney rbe Foundation e il Narsad per il loro generoso sostegno. Abbiamo scoperto che gli agenti neuroattivi possono essere somministrati in modo affidabile a siti cerebrali specifici attraverso una microcannula in vetro di silicato di boro, ottenuta per trazione, con un diametro della punta da cinque a dieci volte più piccolo rispetto a quello delle cannule di somministrazione convenzionali. In questa diapositiva mostriamo una cannula di infusione in acciaio inossidabile comunemente utilizzata accanto a una microcannula che abbiamo realizzato in questo laboratorio.

Questa riduzione delle dimensioni della cannula di somministrazione si traduce in una drastica riduzione del trauma alla regione cerebrale in esame. Molti metodi convenzionali, di fatto, producono una lesione nell'area di interesse o al suo interno, rendendo discutibile la validità di qualsiasi risultato. Qui nel pannello A si può osservare l'entità del danno provocato alla zona locale da una cannula di 0,32 millimetri, confrontato con quello causato da una cannula di 50 micron nel pannello B. Queste immagini a basso ingrandimento mostrano preparati umidi di sezioni Vibram non colorate.

Queste stesse sezioni sono state quindi colorate con ematossilina ed eosina (h e e) e analizzate con un ingrandimento maggiore. Per illustrare ulteriormente la riduzione del danno tissutale ottenuta con la microcannula, i componenti del sistema di microinfusione sono una pompa mini Osmo Zet con il relativo modulatore di flusso in acciaio inossidabile, dal quale è stata rimossa la flangia. Due o tre centimetri di tubo in polietilene, una microcannula in silicato BOA su misura e un filo guida da 28 gauge; questo è il sistema di microinfusione assemblato, pronto per l’impianto.

Viene utilizzato qui un polar verticale standard per pipette per creare microcannule con le specifiche desiderate. Anche i polari orizzontali sono adatti. Il tubo di borosilicato viene posizionato e fissato variando la temperatura dell'elemento riscaldante e la tensione del polar.

È possibile riprodurre in modo affidabile microcannule con diametri specifici e prolungamenti a stelo affusolati di lunghezza desiderata. Il tubo in silice Bora viene riscaldato ed è applicata una pressione delicata per ridurre la quantità desiderata di curvatura del tubo. Questa curvatura viene realizzata a una distanza dalla punta della microcannula che è appropriata rispetto alla profondità della regione cerebrale di interesse e che consente un adeguato spazio libero al di sopra del cranio.

La lunghezza finale di questo tubo distale della microcannula, la curvatura, è di circa nove-dieci millimetri. A quanto pare insoddisfatto del risultato ottenuto, Ryan reinserisce la microcannula per effettuare un aggiustamento fine, perfezionando l'angolo di curvatura.

È molto meglio utilizzare una matita diamantata. Sydney dimostra un metodo per tagliare il tubo in silicato di boro a circa cinque millimetri prossimalmente alla curvatura, tenendo saldamente il tubo su una superficie dura con la porzione distale della microcannula libera di sporgere oltre il bordo. Effettua una incisione circonferenziale sul tubo.

Quindi, applicando una leggera pressione, spezza in modo netto il tubo all'interfaccia segnata. La sottile punta trasparente della cannula può quindi essere colorata con inchiostro indelebile per facilitarne la visualizzazione. Durante l'intervento chirurgico con ingrandimento, la punta della microcannula viene tagliata con forbici da microdissezione fino al diametro desiderato.

Il diametro della punta può essere verificato mediante un oculare o un microscopio. I fili per l'allineamento radicale sono preparati con filo di acciaio inossidabile da 28 gauge, tagliato in lunghezze di circa tre centimetri. Successivamente si utilizzano pinzette per creare un piccolo gancio all'estremità di ciascun filo, di circa due millimetri di diametro.

I fili di allineamento vengono posizionati in una piastra di Petri insieme a spezzoni lunghi due o tre centimetri di tubo in polietilene inseriti nelle microcannule. Il sistema di microinfusione può essere assemblato utilizzando strumenti comuni nella maggior parte dei laboratori. Pinzette microchirurgiche, pinzette convenzionali, forbici chirurgiche e pinze emostatiche vengono disposte in un telo chirurgico per la sterilizzazione.

Gli strumenti, i componenti del sistema di microinfusione e diverse foglie di alluminio sono sterilizzati mediante un normale autoclave. Il modulatore di flusso viene estratto con attenzione dalla confezione e collocato in una piastra di Petri sterile. Viene tenuto saldamente con una pinza emostatica e la flangia di plastica viene rimossa dal tubo modulatore in acciaio inossidabile utilizzando delle forbici.

La mini pompa osmotica viene inoltre rimossa dalla confezione e posizionata nella piastra di Petri sterile. Il tubo in acciaio inossidabile viene inserito nel tubo in polietilene per circa due o tre millimetri e i due vengono sigillati insieme utilizzando una resina epossidica attivata dalla luce. Utilizziamo Lummi bond del mio laboratorio neurale per lavori delicati; riempiamo una siringa da un CC con Lummi bond e usiamo un ago da 27 gauge come applicatore, sotto una luce intensa Lumon indurisce in pochi secondi.

La pompa osmotica miniaturizzata viene riempita tenendola in posizione verticale ed iniettando con attenzione il liquido mediante l'ago di riempimento fornito dal produttore. Si raccomanda di osservare il volume di fluido iniettato nella pompa o di pesare la pompa prima e dopo il riempimento per assicurarsi che sia completamente piena e non difettosa. Si noti che non si consiglia di riutilizzare le pompe.

Il modulatore completo, con il suo tubo in polietilene, viene quindi inserito all'interno della mini pompa osmotica. Il fluido presente nella pompa verrà spinto nel tubo in polietilene mentre il modulatore in schiuma viene inserito. Si prende nota della distanza iniziale del tubo in polietilene riempito con il fluido, che dovrebbe aumentare dopo l'attivazione della pompa mediante incubazione con soluzione salina sterile a 39 gradi Celsius per 12 ore di incubazione.

La pompa osmotica miniaturizzata attivata viene immersa in soluzione salina sterile, che fornisce un ambiente privo di aria per le fasi finali di costruzione del sistema di microinfusione. Una siringa dotata di un tubo di plastica di piccolo calibro e riempita con la stessa soluzione contenuta nella pompa viene utilizzata per spostare l'aria dalla porzione vuota del tubo in polietilene. Si noti che l'aria all'interno della microcannula deve essere spostata.

Allo stesso modo, l'estremità distale del tubo in polietilene potrebbe richiedere un certo allargamento con pinzette microchirurgiche e l'estremità prossimale della microcannula viene quindi inserita. L'intero sistema è ora privo di aria o spazi morti e può essere rimosso dal bagno salino e asciugato con garza sterile. Viene quindi applicato Luma bond per fissare la microcannula al tubo in polietilene. Per ridurre il tasso di flusso della mini pompa osmotica di circa la metà, viene versato del paraffina sterile calda in una piccola capsula di Petri e la metà prossimale della mini pompa osmotica viene immersa brevemente.

Si asciuga l'eccesso di paraffina e il sistema di microinfusione viene riposizionato in soluzione salina sterile e conservato fino all'intervento chirurgico. Poco prima dell'impianto chirurgico, il filo guida viene fissato alla curvatura della microcannula.

L'asse longitudinale del filo guida è allineato con la porzione della microcannula che entrerà nel tessuto cerebrale e viene fissato con lumon. In questa posizione, il sistema di microinfusione può quindi essere posizionato su un manipolatore strumentale stereotassico.

Il filo guida viene fissato con una pinza dell'arto manipolatore e la pompa viene assicurata dall'alto mediante un laccio di sutura sterile. Questo sosterrà il suo peso e permetterà di allineare perfettamente la microcannula perpendicolarmente alla superficie del cranio piegando con cura il filo guida mediante pinze; successivamente, il sistema di microinfusione può essere impiantato utilizzando una procedura stereotassica standard. Il tubo boel viene fissato alla superficie del cranio con un adesivo.

Utilizziamo il mat Jaron per modellare un piedistallo con profilo basso. Il filo guida in eccesso che si estende al di sopra della preparazione viene quindi tagliato a filo con la superficie del piedistallo. Utilizzando una lama da taglio collegata a un trapano ad alta velocità, la mini pompa osmotica può quindi essere posizionata per via sottocutanea tra lo scape dell'animale.

Il metodo attuale offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali. Può essere personalizzato in base alla specie e all'età dell'animale sperimentale. Il tubo di silice può essere modellato in modo da adattarsi alla superficie del cranio dell'animale.

Pertanto, consentendo una fissazione sicura e a basso profilo ed eliminando la necessità di un ampio basamento cranico, la ferita chirurgica può essere facilmente chiusa sopra il basamento microinfusione snello, riducendo così il rischio di infezione e il disagio per l'animale, e il fissaggio del sistema al cranio richiede una superficie minore. Di conseguenza, ulteriori o successivi interventi possono essere eseguiti senza interferenze da parte di un basamento più ingombrante. La cosa più importante, tuttavia, è che questo metodo riduce l'invasività e il trauma nell'ambiente locale del sito di infusione, minimizzando così l'effetto dell'osservatore.

Quelle sono le modifiche che l'osservazione attiva apporterà al fenomeno osservato.