Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

I mitocondri svolgono numerose funzioni nella fisiologia cellulare, dal metabolismo e produzione di energia alla morte cellulare programmata e alla sintesi degli ormoni steroidei. Nonostante l'importanza dei mitocondri sia nelle funzioni cellulari fondamentali che nelle malattie, si conosce ancora molto poco sulla loro funzione nelle cellule staminali embrionali umane e nei loro derivati differenziati. In questo video, vi mostreremo come analizzare i complessi della catena respiratoria mitocondriale delle cellule staminali umane mediante saggi di attività enzimatica in gel.

Ciao, sono Ivan OV del laboratorio di Michael Tetel del Dipartimento di Anatomia Patologica e Medicina di Laboratorio dell'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare la funzione dei complessi respiratori mitocondriali in cellule staminali embrionali umane. Questo metodo di valutazione dell'attività in gel prevede l'isolamento di un estratto mitocondriale grezzo da cellule staminali embrionali umane, la separazione dei complessi mitocondriali del sistema di fosforilazione ossidativa mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide nativo chiaro ad alta risoluzione e successivamente la rivelazione dell'attività in gel.

Iniziamo. Il primo passaggio di questa procedura consiste nell'isolare i mitocondri da cellule staminali embrionali umane. Per questo saggio, utilizzeremo cellule staminali embrionali umane coltivate su una piastra rivestita con matrigel in condizioni senza feeder.

Per raccogliere i mitocondri dalle nostre cellule staminali umane, iniziamo lavandole con PDS caldo 1x a pH 7,4 e quindi trattando le cellule con tripsina per cinque minuti. È possibile utilizzare un millilitro di tripsina 1x per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Dopo cinque minuti, è possibile arrestare la reazione aggiungendo un volume uguale di inibitore fresco della tripsina, uno milligrammo per millilitro in PBS 1x, e raccogliere le cellule.

Le cellule raccolte vengono quindi centrifugate a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in pellet in 0,8-1,7 millilitri di tampone freddo di isolamento delle mitocondri, contenente una miscela appena preparata di inibitori della proteasi 1×. La quantità di tampone da utilizzare dipende dalle dimensioni del pellet cellulare ottenuto. Dopo aver risospeso il pellet, incubarlo sul ghiaccio per circa 10 minuti.

Dopo l'incubazione, lisiamo le cellule con un omogeneizzatore, operazione che potrebbe richiedere circa da 40 a 50 passaggi. Possiamo verificare il completamento dell'omogeneizzazione colorando un'aliquote delle cellule DOD con blu di trian e osservandole al microscopio ottico. Il risultato dovrebbe essere simile a questo.

Questo è il primo prelievo dopo 50 passaggi con il potomat. Questo è il secondo prelievo dopo 80 passaggi con il potomat. Una volta che le cellule sono state omogeneizzate, centrifugarle a 20.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi C. Questo ci fornirà un pellet mitocondriale grezzo, che conterrà anche nuclei e frammenti cellulari più grandi.

Prima della raccolta del pellet, è necessario pesare la provetta di raccolta al fine di stimare il peso successivo del pellet, versare e scartare il soprannatante, quindi pesare il pellet grezzo di mitocondri precipitato. Sottraendo il peso della provetta a questo punto, si può procedere alla solubilizzazione del pellet, che verrà mostrata nel passaggio successivo. Per solubilizzare il pellet mitocondriale grezzo, si inizia mantenendo il pellet sul ghiaccio e sottoponendolo a vortex con 35 microlitri di tampone di solubilizzazione freddo di ghiaccio.

Per ogni 20 milligrammi di pellet, sono disponibili informazioni dettagliate sui composti tampone riportati nel protocollo scritto allegato. Dopo aver effettuato la vortexazione e aver aggiunto il buffer di solubilizzazione, e prima di aggiungere la digitonina, trasferiamo il pellet risospeso in una provetta adatta per centrifugazione ad alta velocità; quindi aggiungiamo 20 microlitri di digitonina al 10% peso/volume per ogni 20 milligrammi di peso del pellet, mescolando agitando leggermente la provetta. Dopo un'accurata miscelazione, incubiamo il pellet mitocondriale da cinque a dieci minuti sul ghiaccio. Doil beta D multiside o DDM oppure Triton X-100 possono essere utilizzati come sostituti della digitonina per solubilizzare le proteine.

La scelta del detergente e della sua quantità può influenzare la formazione di sopra-complessi o forme multimeriche dei complessi mitocondriali dopo l'incubazione sul ghiaccio. Una volta solubilizzato il pellet, verrà centrifugato a centomila volte G per 15 minuti a quattro gradi C; successivamente verrà raccolto il sopranatante limpido. A questo punto siamo pronti per preparare il sopranat游戏副本 da analizzare sul nostro gel a gradiente per l'elettroforesi nativa su gel a gradiente delle mitocondri.

Si consiglia di utilizzare un gel con gradiente di acrilamide dal 5 al 13% con un gel di sovrapposizione (stacking) al 3,5%. Per preparare il gel, utilizzeremo una miscela di acrilamide e bis-acrilamide come descritto nel protocollo scritto. La soluzione di acrilamide e bis-acrilamide viene preparata in anticipo e conservata a quattro gradi Celsius in un luogo al buio.

L'acrilamide e la bis-acrilamide sono sostanze chimiche tossiche sia in forma di polvere che in forma liquida, quindi è necessario prestare particolare attenzione quando si lavora con esse. Combiniamo la soluzione di acrilamide e bis-acrilamide con un'aliquote di tre x tampone per gel composto da 1,5 molar di sei amino esanoico acido e 75 millimolar di ole a pH 7,0. La quantità di soluzione di acrilamide e bis-acrilamide che aggiungiamo al tampone dipenderà dalla percentuale di gel che stiamo preparando per realizzare il gel a gradiente.

Prepareremo una miscela al 4% e una al 13%, mentre il gel di sovrapposizione sarà una miscela al 3,5%. Non dimenticare di aggiungere glicerolo alla miscela al 13%. Quando le tre miscele sono pronte, aggiungiamo una quantità appropriata di perossodisolfato di ammonio e TEMED alle miscele e versiamo le miscele in una camera di polimerizzazione per gradienti.

La parte sinistra della camera contiene la miscela al 5%. La parte destra della camera contiene la miscela al 13% con un piccolo agitatore magnetico. Iniziamo a versare il gel aprendo la parte destra della camera.

Successivamente apriamo immediatamente la parte sinistra della camera e lasciamo che la soluzione al 5% si mescoli con una soluzione al 13% per formare il gradiente. Aggiungiamo una piccola quantità di isopropanolo sulla parte superiore del gel per ottenere un bordo netto e uniforme dopo la polimerizzazione. Circa un'ora dopo, quando la polimerizzazione del gel a gradiente è completa, rimuoviamo l'isopropanolo e versiamo il gel di sovrapposizione al 3,5% nell'apparato, inserendo successivamente un pettine per gel.

Assembleremo ed eseguiremo i gel in una stanza fredda a una temperatura compresa tra quattro e sette gradi Celsius. Per eseguire questo gel, utilizzeremo due tamponi diversi. Nella camera dell'anodo, useremo un tampone contenente 25 millimoli di acido oleico cloridrato, pH 7,0.

Il tampone catodico conterrà 50 millimolar tric, 7,5 millimolare acido oleico cloridrato, 0,02% peso/volume, doil beta D multiside o DDM e 0,05% peso/volume, deossicolato a pH 7,0. Per preparare il sopranatante da caricare nel gel appena versato, si aggiunge tampone di caricamento per ottenere una concentrazione finale di 5% peso/volume di glicerolo e 0,01% peso/volume di Ponto S. Tipicamente, si aggiunge direttamente ai sopranatanti una soluzione madre 10x contenente glicerolo e poncho s.

Ora siamo pronti a caricare il campione sul gel. Caricheremo i pozzetti del gel con un volume contenente da 20 a 40 milligrammi di proteina mitocondriale grezza per corsia. Immediatamente dopo il caricamento, il gel viene eseguito a 100 volt.

Una volta che il campione è entrato nel gel di raccolta, la tensione può essere aumentata a 500 volt con la corrente limitata a 15 milliampere. Sebbene di solito si esegua l'elettroforesi durante la notte a 70-100 volt, si interrompe l'elettroforesi quando una linea netta del colorante rosso zos si avvicina al fronte del gel. Ora che il gel è stato eseguito, possiamo analizzare l'attività dei diversi complessi proteici direttamente nel gel.

Il tempo di incubazione per ogni saggio dipende dall'efficienza della solubilizzazione delle proteine e dalla quantità di materiale caricato per pozzetto. I complessi uno, quattro e cinque di solito producono segnali più intensi rispetto ai complessi due e tre. Per questo motivo, il tempo di colorazione per i complessi due e tre dovrebbe essere più lungo.

Per verificare l'attività del complesso, dovremo utilizzare tamponi specifici per ciascun complesso. Gli ingredienti per i singoli tamponi sono disponibili nel protocollo scritto. Ora ritaglieremo le singole corsie del gel per eseguire separatamente i saggi di attività in gel.

Per tutti i complessi, incubare la fetta di gel nei rispettivi tamponi per diverse ore a temperatura ambiente, tranne che per il complesso cinque. Dopo l'incubazione, fissare il gel in metanolo al 50% e acido acetico al 10% per 15-45 minuti. Il gel fissato viene conservato in acido acetico al 10%.

Qui si osserva come appare la colorazione del complesso I. È presente una banda di colore viola scuro nella fetta di gel che corrisponde al complesso I. I gel trasparenti permettono di eseguire la densitometria delle attività dei complessi mitocondriali e di effettuare analisi comparative.

Dopo la citometria densa, di solito si asciugano le fette di gel per la conservazione a lungo termine e/o per la scansione al fine di ottenere un'immagine di alta qualità. Due complessi mostrano lo stesso colore violaceo del complesso tre e del complesso quattro. Entrambi producono una banda colorata di tonalità arancione o giallastra. Di seguito sono riportati esempi di attività di colorazione del complesso due, tre e quattro.

È stato appena illustrato come analizzare l'attività dei complessi esudativi mitocondriali, estratti da cellule staminali embrionali umane e separati mediante elettroforesi su gel nativo ad alta risoluzione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.