Neutrofili isolamento Protocollo

Protocollo di isolamento dei neutrofili. Questa procedura estrarrà i globuli bianchi da un campione di sangue intero utilizzando una centrifuga e provette. Vortex sir ago e siringa filtro per siringa.

Milli pour brand MX gv 0,22 materiali micrometrici. Per la separazione dei neutrofili, la soluzione salina di Hank richiede due tipi di soluzioni HBSS. L'HBSS con cloruro di calcio verrà utilizzato per preparare una soluzione con albumina sierica umana.

HBSS senza cloruro di calcio verrà utilizzato per sospendere e lavare i neutrofili. Si prega di prestare particolare attenzione a utilizzare la soluzione HBSS appropriata in questa procedura. L'albumina sierica umana o HSA è una proteina presente nel plasma sanguigno che mantiene il pH e la pressione oncotic.

Non utilizzare il tampone per la lisi dei globuli rossi a base di amalgama di siero bovino. Questo prodotto è fabbricato da Roche Diagnostics, mezzo per l'isolamento dei neutrofili NIM Cedar Line Labs, mezzo di separazione Lymph light Poly, da proteggere dalla luce e conservare in frigorifero per ottenere i migliori risultati. Tutti i reagenti devono essere alla temperatura ambiente al momento dell'uso.

Rimuovere i reagenti dal frigorifero un'ora prima dell'esperimento. Preparare la soluzione H-B-S-S-H-S-A per la separazione dei neutrofili. Pipettare HBSS con cloruro di calcio in un vial.

Aspirare l'HSA nella siringa. Evitare di intrappolare bolle d'aria. Rimuovere l'ago della siringa e sostituirlo con il filtro.

Iniettare l'HSA attraverso un filtro nel flacone di HBSS e vorticare per due minuti per miscelare; quando gli altri materiali sono pronti e a temperatura ambiente, prelevare circa 15 millilitri di sangue intero. Questo permetterà di ottenere da 10 a 15 millilitri di neutrofili pari a 10 alla ottava. Il donatore non deve aver assunto alcolici o farmaci da banco nelle 24 ore precedenti la donazione del campione di sangue.

Questi possono interrompere il processo di separazione. Il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA citrato o eparina aggiungendo nove parti di sangue a una parte di K3 EDTA citrato di sodio, oppure eparina seguendo le istruzioni del produttore. I seguenti passaggi verranno descritti in questa procedura.

Separare e rimuovere il plasma e i monociti. Separare ed acquisire uno strato di neutrofili lisando i globuli rossi per ottenere neutrofili liberi in sospensione nella prima separazione. Acquisire i neutrofili nello strato NIM.

Raccogliere cinque millilitri di mezzo di isolamento in un tubo da centrifuga. Posizionare il mezzo di isolamento nella parte inferiore del tubo permette che agisca da filtro, poiché la centrifuga spingerà il sangue attraverso di esso con attenzione. Stratificare cinque millilitri di sangue sopra il NIM per ottenere una separazione pulita.

Si prega di fare molta attenzione a evitare il mescolamento delle soluzioni. Eseguire questo passaggio lentamente e con attenzione, tenendo la punta della pipetta vicina alla superficie del gel risolutivo per prevenire il mescolamento. Centrifugare la soluzione a 500 RCF per 35 minuti.

A 20-25 gradi Celsius, il sangue dovrebbe separarsi in sei bande distinte. Le sei bande sono plasma, monociti, mezzo di isolamento, neutrofili, ulteriore mezzo di isolamento e il pellet di globuli rossi in fondo. Se queste sei bande non sono chiare e distinte, il processo di separazione non è stato corretto e dovrebbe essere ripetuto.

Le cause comuni di una scarsa separazione includono l'utilizzo di un mezzo di isolamento proveniente da un donatore che ha consumato alcol nelle ultime 72 ore o che ha assunto altri farmaci come Tylenol o aspirina. Rimuovere con attenzione e scartare il plasma, i monociti e il mezzo di isolamento. Posizionare questi strati in un tubo sigillabile e scartarli; pipettare con cura lo strato di neutrofili e tutto il mezzo di isolamento al di sotto dei neutrofili in un nuovo tubo da centrifuga pulito per recuperare il maggior numero possibile di neutrofili.

Spesso è più semplice includere anche parte del mezzo di isolamento dello strato sottostante. Non disturbare il pellet sul fondo. Seconda fase: affinare lo strato dei neutrofili.

Diluire la soluzione di neutrofili a 10 millilitri con HBSS senza calcio. Capovolgere il tubo alcune volte per sospendere le cellule centrifugate. La soluzione di neutrofili.

350 RCF per 10 minuti. A una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius, dovrebbe essere presente un pellet rosso sul fondo del tubo contenente i neutrofili e i globuli rossi residui. Rimuovere il sopranatante con la pipetta.

Attenzione a non disturbare il pellet sul fondo. Lisi dei globuli rossi.

Le cellule rosse nel campione devono ora essere distrutte mediante lisi. Per lisare le cellule rosse residue, aggiungere due millilitri di tampone emolitico al tubo per risospendere. Sospendere il pellet e vortexare il flacone a un'impostazione compresa tra tre e quattro.

Evitare di aumentare l'impostazione del vortice oltre il quattro poiché ciò potrebbe causare l'attivazione dei neutrofili. Potrebbe essere necessario vorticare per diversi secondi o effettuare impulsi brevi per sciogliere il pellet. Centrifugare la soluzione di lisi a 250 RCF per cinque minuti.

Utilizzare l'opzione di avvio graduale per ridurre al minimo i danni al campione. Rimuovere il sopranatante con una pipetta. Ripetere il processo di lisi.

Se necessario, per rilasciare la sospensione dei neutrofili, aggiungere 500 microlitri di HBSS senza calcio a ogni provetta. Vortexare il pellet a un'impostazione compresa tra tre e quattro, diluire a 10 millilitri con HPSS senza calcio e centrifugare i neutrofili a 250 RCF per cinque minuti. Aspirare il soprannatante e scartarlo.

Risospendere il pellet in 250 microlitri di soluzione di HBSS con HSA, due volte 10 alla sesta. Di solito si raccolgono neutrofili per millilitro.