Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

La tecnologia della coltura tessutale ha trovato ampie applicazioni nel campo della biologia cellulare. Tuttavia, le cellule in coltura richiedono una manutenzione regolare per rimanere sane. Quando le cellule raggiungono la confluenza, devono essere sottocoltivate o passaggiate.

Il mancato rispetto di questa procedura provoca una riduzione della crescita e, in ultima analisi, la morte cellulare. In questo video, mostriamo come mantenere colture cellulari sia per linee cellulari aderenti che in sospensione. Ciao, sono Ricky, del laboratorio del Dottor LAN presso il Molecular Pathology Laboratories Network nell'East Tennessee.

Oggi voglio mostrarvi due tecniche per il confezionamento di cellule in sospensione e di cellule aderenti. Per il passaggio di una piastra di cellule, dovremo partire da una coltura primaria cresciuta fino a confluenza in una piastra di Petri da 60 millimetri o in un fiasco per colture cellulari da 25 centimetri quadrati contenente cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare.

Iniziamo rimuovendo tutto il mezzo dalla coltura primaria mediante pipetta sterile. Successivamente laviamo il monostrato di cellule aderenti una o due volte con un piccolo volume di HBSS a 37 gradi Celsius privo di calcio e magnesio, per rimuovere qualsiasi traccia residua di siero bovino fetale che potrebbe inibire l'azione dell'enzima tripsina che verrà aggiunto nel passaggio successivo.

Successivamente, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di tripsina EDTA tiepida alla coltura, in modo da coprire lo strato di cellule aderenti. Quindi, posizionare la piastra su un piatto riscaldante a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Al termine dell'incubazione, battere delicatamente il fondo della piastra su una superficie piana per staccare le cellule.

Controllare la coltura con un microscopio invertito per verificare che le cellule siano arrotondate, segno che si sono staccate dalla superficie. Se le cellule non si sono staccate sufficientemente, rimettere la piastra sul vassoio riscaldante per un minuto o due aggiuntivi. Dopo aver osservato al microscopio, risciacquare la piastra con mezzo completo e trasferire la sospensione con una pipetta in un tubo conico da 15 ml contenente 2 ml di mezzo completo.

Centrifugare le cellule per formare il pellet e risospendere il pellet nel mezzo completo. Aggiungere ora un volume uguale di sospensione cellulare in ciascuna delle piastre fresche precedentemente etichettate. In alternativa, le cellule possono essere contate utilizzando un emocitometro e diluite alla densità desiderata in modo da aggiungere un numero specifico di cellule in ciascuna piastra.

Assicurarsi di etichettare ogni piastra con la data del sottocoltura e il numero di passaggio. Dopo aver aggiunto la sospensione cellulare, aggiungere un mL di mezzo fresco a ciascuna nuova coltura. Incubare quindi le piastre in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e 5%CO2.

Dopo aver incubato le cellule durante la notte, aggiungere mezzo fresco alle piastre e riposizionarle a 37 gradi. Una volta che la piastra ha raggiunto la confluenza, è possibile passaggiare nuovamente la piastra ripetendo questa procedura e continuare con ulteriori passaggi secondo necessità. Ora vi mostreremo come passaggiare le cellule in coltura in sospensione.

La conservazione di cellule in coltura in sospensione è più semplice rispetto a quella di cellule aderenti. Prima di conservare colture in sospensione, le cellule devono essere mantenute con aggiunte di mezzo ogni due o tre giorni fino al raggiungimento della confluenza, ovvero quando le cellule si raggruppano nella sospensione e il mezzo appare torbido. Quando si agita il flacone.

Per fare ciò, rimuovere il matraccio contenente le cellule in sospensione dall'incubatore, avendo cura di non disturbare quelle che si sono depositate sul fondo del matraccio. In condizioni asettiche, rimuovere e scartare circa un terzo del mezzo dal matraccio e sostituirlo con un volume equivalente di mezzo preriscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo aver cambiato il mezzo, agitare delicatamente il matraccio e riporlo nell'incubatore, che è a 37 gradi Celsius, 5%CO2.

Se sono presenti meno di 15 ml di mezzo, incubare il flacone in posizione orizzontale per migliorare il contatto tra cellule e mezzo. In caso contrario, il flacone può essere incubato in posizione verticale nei giorni in cui le colture non vengono alimentate. Controllarle agitando delicatamente i flaconi per risospendere le cellule.

Assicurarsi di osservare eventuali cambiamenti di colore del mezzo che indicano una buona crescita metabolica. Una volta che le colture sono confluenti, il che corrisponde a circa 2,5 milioni di cellule per mil, è possibile effettuare il passaggio. Ancora una volta, abbiamo appena mostrato come effettuare il passaggio di cellule coltivate sia per colture aderenti che in sospensione.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.