Intervista: Bioreattori e nobilitati-Modified 3D-Ponteggi per la ricerca sulle cellule staminali

Mi chiamo Karlan e lavoro come biofisico presso l'Istituto per le Interfacce Biologiche. Presso il Cal Screw Institute of Technology, sviluppiamo bioreattori e scaffold tridimensionali con superficie modificata per la coltivazione di tessuti funzionali e per la ricerca sulle cellule staminali; siamo principalmente interessati all'interazione tra cellule e il loro ambiente artificiale. Un editoriale di Nature del 2003 poneva la domanda: «biologia piatta?», e la domanda è: cosa si intende con questo?

In passato, molti sistemi di coltura in vitro, principalmente colture a monolayer, hanno sofferto degli svantaggi per cui, ad esempio, le cellule primarie differenziate avevano una durata relativamente breve e si de-differenziavano durante la coltura. Ciò significa che perdevano rapidamente la maggior parte delle loro funzioni specifiche dell'organo. Pertanto, al fine di riprodurre condizioni migliori per queste cellule in vitro, sono state apportate numerose modifiche e adattamenti alle colture convenzionali a monolayer.

E ciò include la composizione del mezzo di coltura e il rivestimento creato dei vasi di coltura in cui le cellule formano prevalentemente monostati. E tutti questi approcci indicano l'importanza delle interazioni tra cellula e matrice, così come della comunicazione tra cellula e cellula. Un altro aspetto importante sembra essere l'instaurazione di contesti specifici per le cellule, che vengono realizzati, ad esempio, da complessi giunzionali a gap, una caratteristica comune di molte cellule in vivo.

Nelle colture convenzionali in monocstrato, la comunicazione giunzionale tramite gap junction viene rapidamente persa. Per un lungo periodo, è stato possibile ristabilire in vitro, in una certa misura, un'organizzazione cellulare simile a quella di un tessuto, utilizzando la cosiddetta tecnica degli aggregati.

Un esempio del nostro laboratorio è che siamo riusciti a dimostrare come anche gli epatociti adulti di ru possano formare steroidi e rimanere vitali per almeno alcune settimane all'interno di questi aggregati. Gli epatociti rimangono in stretto contatto tra loro, favorendo la comunicazione cellulare che porta alla stabilizzazione delle funzioni specifiche degli epatociti. Tuttavia, abbiamo anche scoperto che questa tecnica convenzionale di coltura tridimensionale presenta diversi svantaggi.

La dimensione degli aggregati è fondamentale. Aggregati con diametro elevato possono indurre necrosi e, nella maggior parte dei casi, il rapporto tra volume del mezzo e numero di cellule è inadeguato. Inoltre, le forze di taglio e le colture in agitazione possono risultare problematiche.

Gli organi e i tessuti negli organismi viventi sono, tra l'altro, caratterizzati da densità cellulari molto elevate; inoltre, il trasporto attivo diretto di sostanze attraverso questi strati di tessuto rappresenta una caratteristica importante. Pertanto, modelli di tessuti in vitro di tipo organotipico realistici dovrebbero ricostruire nel modo più fedele possibile questa architettura naturale. Un determinante essenziale per i limiti di tali sistemi è il rapporto appropriato tra volume di mezzo e volume cellulare.

Ho menzionato in precedenza che abbiamo progettato un'apposita struttura cellulare costituita da un'impalcatura polimerica microstrutturata con precisione, che offre contenitori di dimensioni uniformi per la coltura tridimensionale di aggregati cellulari. Per l'impalcatura polimerica, utilizziamo preferibilmente PMMA o polietere PC, oppure policarbonato. Questa è composta da un dispositivo plantare microstrutturato di un centimetro quadrato, che offre un fitto reticolo di oltre 1000 di questi contenitori.

Per la coltura tridimensionale di aggregati cellulari, si è dimostrato adatto per la coltura cellulare 3D per diverse settimane. E ciascuno di questi piccoli contenitori cubici nell'array ha un lato di circa 300 micrometri. Il design speciale di questo scaffold e della periferia, ovvero della camera di incubazione.

Il mezzo e l'alimentazione gassosa consentono diverse modalità di somministrazione del mezzo. Primo, la superfusione, ovvero entrambi i lati del tessuto vengono alimentati separatamente con mezzo nutritivo, e in secondo luogo, la perfusione.

Ciò significa che il flusso medio è costretto a penetrare lo strato di tessuto. La modalità di perfusione può essere utilizzata per creare condizioni che simulano meglio la vascolarizzazione in vivo, ma è possibile anche una modalità mista di perfusione e superfusione. Sono state sviluppate diverse generazioni di cell ship.

Ogni generazione può essere utilizzata con un determinato design per soddisfare le esigenze di qualsiasi applicazione specifica. Ad esempio, sono stati realizzati design di biorreatori singoli e doppi, così come configurazioni multivolume indirizzabili separatamente o sistemi altamente paralleli di Variance. Come versioni ingrandite dell'ultima generazione di queste diverse forme, per i cosiddetti contenitori microtermoformati è stata sviluppata una certa tecnologia, che offre la possibilità aggiuntiva di modificare l'intera superficie di questi contenitori tridimensionali, permettendo persino un patterning della superficie e l'immobilizzazione di molecole segnale su scala submicrometrica.

Inoltre, possono essere incorporati sensori ed elettrodi di segnale. Le applicazioni spaziano dalla ricerca di base e dalla biologia cellulare alla tossicologia e alla farmacologia, ed è possibile anche lo screening ad alto rendimento. Un punto molto importante da sottolineare alla fine è il fatto che l'ultima generazione dei nostri chip microtermoformati è stata ottimizzata per consentire processi di produzione di massa a basso costo e quindi l'applicazione in altri laboratori.