Intervista: HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved

Sono JohE Hvar e mi sto recando al Dipartimento di Biologia Cellulare e Biologia, presso l'HE Pet Institute di Amburgo, in Germania. L'HE PET Institute è un istituto di ricerca fondamentale che si concentra esclusivamente su virus patogeni umani e su questioni ad essi correlate, direi. Il nostro dipartimento è principalmente interessato allo studio della regolazione dell'espressione genica dell'HIV e alle interazioni, in particolare quelle intracellulari, tra l'HIV e i componenti della cellula ospite.

Sulla base di questi dati, cerchiamo inoltre di sviluppare terapie sperimentali innovative per la malattia da HIV. Il problema con l'HIV è che si tratta di un retrovirus o lentivirus e, come ogni retrovirus, l'HIV integra, dopo l'infezione della cellula ospite, il genoma virale nel genoma della cellula ospite. Finora, non è possibile eliminare il provirus integrato.

Ciò significa che, in termini di terapia, stiamo parlando di una malattia cronica che richiede un trattamento a vita e, fondamentalmente, di tutti i problemi associati alle terapie a lungo termine, come gli effetti collaterali dei farmaci, l'insorgenza di resistenza, ecc. Per molti anni, nella ricerca di base, conosciamo quelle che vengono chiamate ricombinasi, naturalmente presenti in processi di ricombinazione, ad esempio nei lieviti o nei batteri. Queste ricombinasi riconoscono specifiche sequenze di DNA, riorganizzano i geni e riarrangiano il genoma e così via.

E in particolare, una ricombinasi chiamata decre ricombinazione viene utilizzata nella ricerca di base e nella situ nella ricerca di base. E CRE riconosce essenzialmente la sua sequenza specifica. E se si ha una sequenza situata tra due siti di riconoscimento, CRE è in grado di escindere la sequenza interposta fondamentalmente.

L'idea, già presente da 10 o 15 anni, è da un lato quella di eradicare il virus nella medicina, e dall'altro di utilizzare, ad esempio, ricombinasi come Grief per escindere il provirus. Il DNA, in teoria, potrebbe essere eliminato perché, dopo l'infezione, l'HIV trascrive al contrario il suo genoma a RNA in DNA e, grazie a questo processo di trascrizione inversa, vengono generate delle sequenze chiamate ripetizioni terminali lunghe (LTR), che delimitano sostanzialmente l'estremità 5' o inizio e l'estremità 3', ovvero la fine, del provirus integrato nel DNA. In teoria, se si riuscisse a sviluppare un sistema di ricombinazione triplice che riconosca specificamente una sequenza all'interno dell'LTR, la ricombinasi attaccherebbe l'estremità 5' e l'estremità 3' del provirus integrato, escindendo il DNA e, di fatto, eradicando il virus dalla cellula infetta. Ora, il problema con l'HIV è che esistono diversi isolati, forse persino in un singolo individuo, in un singolo paziente; tuttavia, per quanto ne sappiamo finora, la sequenza all'inizio e alla fine del genoma virale risulta conservata.

In altre parole, gli LTR sono più conservati, ad esempio, rispetto ai geni dell'HIV. Perciò ritengo che ci sia una buona probabilità di riuscire a utilizzare solo un numero ridotto di ricombinanti in grado di riconoscere la stragrande maggioranza di tutti gli isolati di HIV. E se così non fosse, allora dovremmo generare un nuovo ricombinante mediante evoluzione molecolare, un processo che in futuro potrebbe essere semi-automatizzato.

E lo farà, il processo sarà molto più veloce rispetto a eseguirlo in laboratorio. Nel nostro caso, il collega Dr. Frank dell'Istituto Max Splunk è entrato in gioco. Fondamentalmente, è un esperto di ricombinasi e di tutto ciò che vi è connesso.

Fondamentalmente, ciò che ha utilizzato è ciò che noi chiamiamo un metodo di evoluzione molecolare. Tuttavia, il metodo si basa sulla tecnologia della reazione a catena della polimerasi (PCR). Egli prende il gene della ricombinasi naturalmente presente, degree combs, e allestisce una reazione PCR o multiple reazioni PCR in condizioni che introducono in modo casuale delle mutazioni.

E ora il trucco consiste nel selezionare le nuove versioni della ricombinasi che hanno acquisito una nuova capacità o attività, ovvero il riconoscimento di sequenze specifiche dell'HIV. E ciò viene fatto in cicli ripetuti. Sono stati necessari circa 120 o più di 120 cicli per applicare questo tipo di metodo di evoluzione molecolare.

Quando finalmente ha sviluppato questo specifico sistema, ora chiamato tre per la ricombinazione specifica dell'LTR, con questa nuova ricombinasi che riconosce in modo specifico le sequenze dell'HIV. Lo studio iniziale è stato quindi condotto qui, e gli esperimenti con le ricombinasi sono stati eseguiti presso l'HE PET Institute di Amburgo. Quello che abbiamo fatto, in particolare, è stato somministrare questa ricombinasi, mediante vettori genici, in colture cellulari umane precedentemente infettate con un isolato clinico, più o meno rappresentativo, dell'HIV-1.

E nel tempo, nell'arco di sei-otto settimane, siamo stati in grado di dimostrare ciò. Ora, il ricombinante è quantitativamente entusiasmante: integrando il profilo HIV DA, fondamentalmente l'intera coltura viene guarita eliminando l'HIV. Esistono certamente numerosi problemi con questa tecnologia.

Prima di tutto, dobbiamo assicurarci che l'espressione della ricombinasi non causi effetti collaterali tossici. Non ce lo aspettiamo, perché per ricombinazioni naturali come gre, esistono animali transgenici cosiddetti. Essi esprimono questa ricombinazione GRE e, va bene, ci sono alcuni problemi, ma non troppo significativi.

Posso dirlo a questo punto. Quindi c'è speranza che non ci siano effetti collaterali tossici, ma non si può mai sapere finché non si eseguono gli esperimenti. Inoltre, esistono anche problemi per cui potremmo non riconoscere ogni isolato clinico, permettendoci così di eliminare l'isolato dominante, l'isolato di HIV, in un paziente.

Ma selezioneremo da isolati minori, nel tempo. Questo è, non lo sappiamo, dobbiamo effettuare questi esperimenti. Poi c'è un grosso problema con il trasferimento genico, con la tecnologia dei vettori.

Dobbiamo utilizzare i cosiddetti vettori lentivirali o anche vettori retrovirali per trasferire il gene o il gene della ricombinasi. Dunque, esistono effetti collaterali? Sì, questi vettori provocano effetti tossici?

Queste sono tutte le domande che abbiamo. Inoltre, speriamo di migliorare l'attività dei pettini. Cioè, la ricombinazione agisce più rapidamente di quanto riusciamo a osservarla attualmente, nell'arco di alcune settimane, l'attività.

Quindi queste sono tutte domande aperte che dovremo affrontare nei prossimi anni. E questo è attualmente un problema certo, poiché le ricombinasi non sono disponibili per via orale. Pertanto, non esisterà una pillola, una pillola di ricombinasi, così semplice, che ti permetta di eliminare il virus.

Pertanto, ma speculando sulle terapie future, dobbiamo considerare gli approcci della terapia genica. Forse si potrebbe immaginare di isolare le cosiddette cellule staminali ematopoietiche o cellule CD34 positive dal sangue di pazienti infettati da HIV. E successivamente, in laboratorio, introdurre il gene per i combs in queste cellule del paziente.

Infine, re-introduciamo, reiniettiamo le cellule del paziente, le re-infondiamo nel medesimo paziente. Quello che dovrebbe accadere è che il sistema immunitario o il sistema ematopoietico del paziente, nel tempo, si ricostituisca almeno parzialmente con cellule che, in caso di infezione da HIV, sono in grado di eliminare il virus perché ora esprimono una ricombinasi. L'effetto sarebbe quindi una riduzione della carica virale nel paziente, con un conseguente miglioramento della qualità della vita.

E possiamo anche sperare che il sistema immunitario si stia ricostituendo in questi pazienti, almeno in parte. Ora, la, la, la funzione, le cellule immunitarie che sono completamente funzionali, dovrebbero essere in grado, si spera, di attaccare le rimanenti cellule infette nel paziente. Se sia o meno possibile eradicare completamente l'HIV da un paziente, al momento non possiamo dirlo.