Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Sea elegance è un organismo modello incredibilmente utile grazie sia alla nostra conoscenza delle sue linee cellulari sia alla grande quantità di informazioni ottenute dal sequenziamento e dall'analisi del suo intero genoma. In questo video, illustriamo il processo di microiniezione di plasmidi in sea elegance e la selezione di prole transgenica mediante microscopia fluorescente. Essendo un animale trasparente e multicellulare, sea elegance è ideale per la visualizzazione in vivo di transgeni che esprimono proteine etichettate con fluorescenza. Ciao, mi chiamo Laura Berkowitz e sono un'associata di ricerca nel Caldwell Lab del Dipartimento di Scienze Biologiche qui all'Università dell'Alabama.

E io sono Adam Knight, anch'io del laboratorio Calwell dell'Università dell'Alabama. Oggi vi mostrerò come prepararsi ed eseguire la microiniezione di plasmina per generare ricci di mare transgenici, e vi mostrerò anche come selezionare e mantenere linee di ricci di mare transgenici. Cominciamo dunque.

Prima di iniziare la microiniezione, dobbiamo eseguire alcuni passaggi preparatori, che vi mostrerò ora. Preparare prima il DNA plasmidico da iniettare: sono necessari due plasmidi, uno che codifica per l'espressione specifica del tessuto del nostro gene di interesse e un secondo che fornisce un marcatore di trasformazione selezionabile. Mescolare i plasmidi insieme in un rapporto uno a uno di 50 nanogrammi per microlitro.

Successivamente, preparare i cuscinetti a vite, che verranno utilizzati per immobilizzare i vermi durante l'iniezione. Per realizzare i cuscinetti a vite, posizionare innanzitutto alcuni vetrini di dimensioni 22 per 50 millimetri sul bancone del laboratorio. Utilizzando una pipetta Pasteur, depositare una goccia di agarosio fuso al 2% su un vetrino e immediatamente appoggiare un secondo vetrino sulla goccia, disponendolo perpendicolarmente, cioè a un angolo di 90 gradi, rispetto al primo.

Lasciare solidificare l'aerogel per alcuni secondi, quindi rimuovere il vetrino superiore. Il diametro del disco appiattito di aerogel dovrebbe essere compreso tra 15 e 20 millimetri. Come per un animale domestico, lasciare asciugare completamente il pad all'aria per diverse ore o durante la notte.

Una volta asciutte, conservare le piastre in una scatola di vetro coperta a temperatura ambiente. Successivamente, preparare i caricatori per l'ago con la soluzione di DNA. A tale scopo, prendere un capillare da cento microlitri e riscaldarlo al centro con una fiamma libera, quindi tirarlo rapidamente fino a raggiungere circa il doppio della sua lunghezza.

Dopo che il capillare si è raffreddato, spezzare in due parti le estremità. Accumulare da 10 a 20 caricatori per microago da utilizzare per l'iniezione. È possibile conservarli in posizione verticale all'interno di una provetta per microcentrifuga.

Brack, faccia attenzione. Le punte del caricatore di aghi sono molto affilate. Ora prepari gli aghi per microiniezione.

Questi aghi sono realizzati a partire da un tubo capillare speciale che contiene un filamento di vetro interno. Questo filamento funge da stoppino per la soluzione di DNA. Per fabbricare gli aghi, utilizziamo un Niki PP eight 30 Polar con un'impostazione di calore pari a 24,8, e vengono tirati contemporaneamente diversi aghi per la conservazione.

È possibile montare più aghi su una striscia di argilla modellabile. Piccoli frammenti di vetrino verranno utilizzati per rompere la punta dell'ago tratto. Questi frammenti vengono preparati avvolgendo un vetrino di 18 per 18 millimetri in un fazzoletto Kim e applicando delicatamente pressione fino a quando si rompe in diversi pezzi.

Utilizzare frammenti di dimensioni pari a circa tre per quattro millimetri. Oltre a preparare il DNA e gli aghi, preparare circa da 50 a 100 esemplari adeguatamente stadiati. Due esemplari di vermi di tipo selvatico per ciascun costrutto vettoriale di espressione da iniettare.

Ora siamo pronti per configurare il microscopio per microiniezione. Per iniziare la configurazione del microscopio, aprire la valvola principale della bombola di elio collegata al braccio e al supporto dell'ago per microiniezione. Chiudere il regolatore per consentire al gas di entrare nella linea.

Portando la pressione a 35 PSI, il gas può essere rilasciato utilizzando un pedale a pressione. Successivamente, inserire un caricatore di aghi in un tubo di pipetta manuale standard e aggiungere una piccola quantità della miscela plasmidica, circa un microlitro. Ora inserire delicatamente il caricatore completamente all'interno dell'ago per microiniezione fino a quando non si avverte resistenza.

Espellere la soluzione di DNA soffiando delicatamente, quindi rimuovere il caricatore. Una volta caricato il DNA, inserire l'ago nell'arto di microiniezione, avendo cura di posizionarlo all'interno della piccola guarnizione di gomma interna, quindi fissarlo al braccio del manipolatore. Successivamente, posizionare un frammento di vetrino coprioggetto per la rottura dell'ago su un bordo del tappetino per ago.

Coprire il frammento e l'intera superficie del tampone elicoidale con olio di carbonio vuoto. Quindi posizionare il tampone elicoidale sul palchetto di un microscopio invertito. Una volta che il tampone elicoidale è posizionato, centrare l'ago nel campo visivo utilizzando l'obiettivo Forex e l'illuminazione a campo chiaro, senza però abbassarlo ancora nell'olio.

Posizionare successivamente il bordo interno del frammento di vetrino coprioggetto al centro, quindi metterlo a fuoco. Abbassare l'ago nell'olio, portandolo nello stesso piano focale del frammento di vetrino coprioggetto. Aumentare l'ingrandimento passando all'obiettivo 40x, quindi rimettere a fuoco sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell'ago se necessario.

Ora rompere l'apertura della punta dell'ago di iniezione. Spingere delicatamente l'ago contro il bordo del frammento di vetrino, applicando contemporaneamente un breve impulso di gas tramite il pedale. L'ago verrà così sufficientemente aperto.

Quando piccole gocce di liquido fuoriescono dall'estremità dell'ago a causa di un'apertura troppo grande, il flusso eccessivo di liquido non è desiderabile poiché ucciderebbe gli animali. Una volta che l'ago è pronto, iniziamo la microiniezione. Successivamente, rimuovere il tampone dell'arco dallo stadio sollevando l'ago.

Ma non modificare la posizione degli assi X o Y. Estrarre la piastra da sotto l'ago. Rimuovere il tampone elicoidale e posizionarlo su un microscopio stereoscopico.

Trasferisci un verme sul tampone posizionato al di sotto della superficie dell'olio. Se il verme si muove leggermente, accarezzalo finché non entra in contatto con il tampone dell'ago, il verme umido dovrebbe aderire all'ago secco. Posiziona rapidamente il tampone dell'ago nuovamente sul palco, centrando il verme nel campo visivo.

Quindi abbassare l'ago fino a portarlo nello stesso piano di fuoco del verme. Passare ai filtri sul microscopio invertito per l'illuminazione Hoffman. Questo filtro di contrasto permette di rendere visibili i dettagli morfologici del verme.

Utilizzando l'obiettivo 40x, mettere a fuoco il centro sensoriale granulare della gonade del verme situato al di sotto del modello a nido d'ape dei nuclei germinativi. Scegliere la gonade posizionata sul lato del verme rivolto verso l'ago. Regolare con precisione la posizione dell'ago finché anche la punta risulti a fuoco.

Inserire delicatamente l'ago al centro della gonade ed applicare un breve impulso di pressione gassosa per espellere una o due gocce di DNA nel braccio della gonade. Con molta pratica e abilità, si dovrebbe osservare un'onda di liquido diffondersi lungo la gonade distale. È possibile colpire ogni volta il centro della gonade.

Tenere presente che è importante lavorare rapidamente durante l'iniezione di un verme, poiché può disidratarsi facilmente. L'intero processo dovrebbe idealmente richiedere meno di uno o due minuti.

Una volta completata l'iniezione, rimuovere il cuscinetto dell'archetto dalla piastra e posizionarlo su un microscopio stereoscopico. Applicare un microlitro di buffer M nine direttamente sul verme iniettato. Questo potrebbe richiedere di immergere la punta della pipetta al di sotto della superficie dell'olio halo carb.

Il buffer dovrebbe reidratare il verme, che successivamente galleggerà sulla superficie del pad aeros; trasferire il verme su una piastra normale utilizzando un worm pick. Ora consegnerò i vermi iniettati ad Adam, che ci mostrerà la selezione e il mantenimento delle linee transgeniche. I vermi iniettati vengono trasferiti su piastre fresche da 60 millimetri individuali, seminate, e lasciati riprodurre.

Questi vermi rappresentano la generazione P zero. Generalmente, gli animali iniettati vengono incubati a 20 gradi Celsius per due o tre giorni, fino alla comparsa della prole. Una volta che la prole appare, siamo pronti per iniziare la selezione dei vermi transgenici.

I progeni F1 vengono osservati per verificare la presenza del marcatore transgenico. In questo caso, il marcatore selezionabile è fluorescente, quindi possiamo effettuare lo screening utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Ogni animale F1 portatore del marcatore fluorescente viene clonato separatamente in una nuova piastra.

Il P zero iniettato può produrre solo da uno a cinque prole fluorescenti tra tutti i suoi F1. Lasciare che gli ermafroditi F1 si riproducano a 20 gradi per due o tre giorni, fino a quando non compaiono i discendenti. Una volta pronta la generazione F2, anche questa viene osservata alla ricerca di animali transgenici. Gli animali F2 che hanno ereditato ed espresso un marcatore transgenico sono considerati una linea stabile.

Ogni linea stabile indipendente deve essere mantenuta come una linea separata di vermi; propagare ciascuna linea trasferendo diversi animali transgenici in una nuova piastra a ogni generazione. Questa operazione deve essere eseguita utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Se il marcatore selezionabile è fluorescente, al fine di controllare la variabilità nel numero di copie del gene, generare almeno tre linee stabili indipendenti per ogni costrutto iniettato.

Abbiamo appena mostrato come eseguire microiniezioni di costrutti vettoriali di espressione e come selezionare linee stabili. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.