L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

Nel laboratorio Caldwell, noto anche come Worm Shack, studiamo i meccanismi delle malattie neurologiche in Caenorhabditis elegans. E dopo una lunga giornata di esperimenti fruttuosi, ci premiamo con qualche attività ricreativa. Ciao, sono Adam Knight, studente universitario del laboratorio Calwell del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Alabama.

Oggi, io e altri mostreremo come eseguire un saggio di degenerazione dei neuroni dopaminergici in C. elegans. Incrocerò una ceppa di vermi con neurodegenerazione dopaminergica con ceppi transgenici che sovraesprimono geni candidati correlati alla malattia e neuroni dopaminergici. Ciao, sono Adam Harrington, studente laureato nel Caldwell Lab.

Oggi vi mostrerò come preparare i vermi transgenici per l'analisi dei neuroni dopaminergici. Ciao, sono Shu Amichi e sono uno studente laureato. Qui vi mostrerò come eseguire il saggio dei neuroni dopaminergici di C. elegans, che vengono chiamati ceps e aides.

Generalmente, i vermi che esprimono solo GFP nei neuroni dopaminergici non mostrano morte cellulare. Tuttavia, in presenza di CLE, si osserverà una neurodegenerazione dipendente dall'età. Utilizzando questo saggio, un transgene può essere co-espresso nei neuroni dopaminergici per determinare se è in grado di potenziare o inibire la tossicità indotta da CLE. Cominciamo dunque.

Prima di eseguire l'analisi dei neuroni dopaminergici, dobbiamo innanzitutto incrociare le ceppi GaN appropriati per posizionare otto esemplari che esprimono sia alphas nucle che GFP sotto il controllo del promotore specifico per i neuroni dopaminergici dat-1 su una piastra di accoppiamento. Aggiungere ora due L4 transgenici di sesso ermafrodita che mostrano un'espressione specifica per i neuroni dopaminergici del nostro gene di interesse candidato, nonché un'espressione nelle cellule della muscolatura della parete corporea del marcatore fluorescente selezionabile DS-Red2. È importante notare che per ogni costrutto transgenico generiamo tre linee transgeniche stabili.

Pertanto, questo incrocio genetico deve essere eseguito singolarmente per ciascuna delle tre linee stabili distinte create. Dopo due giorni, rimuovere e scartare i maschi dopo ulteriori due o tre giorni. Esaminare la generazione F1.

Ci sono diversi prole maschile e l'accoppiamento è stato di successo. Successivamente, trasferire singolarmente su nuove piastre cinque animali L4 di Aphrodite da ciascun incrocio che mostrano sia il marcatore fluorescente GFP ereditato dal genitore maschio sia il marcatore rosso DS due muscoli della parete corporea fluorescenti ereditato dal genitore hamadi. Gli animali trasferiti devono essere allo stadio L4 per assicurarsi che non abbiano ancora subito la M it.

Con la presenza di animali maschi sulla piastra, lasciare che gli animali si autofecondino per tre o quattro giorni per produrre prole F2. Ora eliminare la prole F2 facendo così: trasferire da cinque a dieci animali che mostrano entrambi i marcatori cent su piastre individuali separate.

Quindi esaminare la generazione F3 per identificare le piastre in cui il cento percento degli animali esprime GFP nei neuroni dopaminergici e in cui alcuni animali esprimono anche il marcatore fluorescente DS-Red2 nelle cellule muscolari della parete corporea. Questi animali saranno omozigoti per i geni dell'alpha-sinucleina e della GFP e trasmetteranno stabilmente il transgene appena creato. Una volta completato lo screening, si potrà procedere all'analisi dei neuroni dopaminergici.

Per iniziare l'analisi dei neuroni, preparare una piastra fresca con i tre animali F identificati nel passaggio precedente. Impostare una piastra per ciascuna delle tre linee transgeniche. In aggiunta, piastrare il ceppo contenente soltanto la GFP alfa-sinucleina come controllo e lasciare che i vermi crescano fino all'età adulta.

Una volta raggiunta la maturità, trasferire da 30 a 40 animali transgenici per ogni linea su una piastra fresca. Lasciarli deporre le uova per cinque ore a 20 gradi Celsius. Trascorse cinque ore, rimuovere e scartare.

Gli adulti permettono agli embrioni di svilupparsi per tre o quattro giorni a 20 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio L4. Successivamente, selezionare circa cento animali transgenici allo stadio L4 e trasferirli in una piastra contenente 0,04 milligrammi per millilitro di 5-fluoro-2-deossiuridina.

Questo analogo dei nucleotidi impedisce lo sviluppo della generazione successiva attraverso l'inibizione della sintesi del DNA. Poiché le piastre FDUR sono sensibili alla luce, proteggerle tenendole coperte e avvolte completamente. Preparare un tampone agarosio per l'analisi dei vermi.

Vengono utilizzati freschi e non devono essere lasciati asciugare. Preparare due vetrini con un pezzo di nastro adesivo disposto longitudinalmente su ciascuno. Il nastro funge da spaziatore per ottenere cuscinetti di spessore uniforme.

Posizionare un terzo vetrino tra i due sul banco. Sono disposti. Tre in fila.

Posizionare una goccia di arus fuso sul lato centrale e appoggiare rapidamente un altro vetrino sopra l'agros perpendicolarmente a due e attraverso tutti e tre i vetrini. Ripetere per preparare diversi cuscinetti aggiuntivi, tanti quanti necessari per il numero di campioni da analizzare. Una volta pronti i cuscinetti di auger, posizionare una goccia di sei microlitri di anestetico a tre millimolari, 11 mile saw, su un vetrino coprioggetto di 22 per 30 millimetri.

Prelevare 40 animali adulti nella goccia, quindi capovolgere il vetrino coprioggetto sul tampone di agarosio. Ripetere l'operazione per ciascuna delle altre linee. Valutare 30 animali per ogni linea per la presenza di ciascun CEP e di un neurone D.

Utilizzando un microscopio composto con illuminazione epi fluorescente e un cubetto filtro che permette la visualizzazione di FITC o GFP, impiegheremo un cubetto filtro endo G-F-P-H-Y-Q per registrare i dati su un foglio di valutazione. Gli animali di tipo selvatico conservano un GFP completo nei corpi cellulari di tutti e quattro i neuroni CEP e dei due neuroni ADE. I singoli animali che mostrano perdita di segnale nei neuroni D vengono classificati come di tipo selvatico noto o in degenerazione.

Questi neuroni vengono registrati come LG o perdita di GFP. Allo stesso modo, il grado di degenerazione può essere valutato contando il numero totale di neuroni persi in ciascun animale, oltre al fatto che la popolazione ripete l'analisi altre due volte. Utilizzando altri 30 animali per linea per ogni prova.

Viene calcolata la media del numero totale di vermi che presentano neuroni dopaminergici di tipo selvaggio provenienti dalle tre ripetizioni dell'analisi. L'analisi statistica per la neuroprotezione viene quindi eseguita utilizzando il test t di Student con un valore P inferiore a 0,05. Per confrontare i vermi di controllo con ceppi che overesprimono geni candidati nei neuroni dopaminergici, effettuare questa analisi in diversi giorni successivi alla deposizione delle uova; i giorni appropriati per l'analisi sono determinati empiricamente.

Ad esempio, abbiamo determinato che il 77%, l'87% e il 90% degli animali alpha CLE più GFP mostrano neuroni dopaminergici degenerati rispettivamente al sesto, settimo e decimo giorno dopo lo sviluppo. Pertanto, se prevediamo che il transgene di interesse possa potenziare la neurodegenerazione, l'analisi verrà effettuata al sesto giorno. Analogamente, i transgeni che potrebbero sopprimere la neurodegenerazione verranno analizzati al settimo e al decimo giorno.

È stato appena mostrato come eseguire un saggio di neurodegenerazione dopaminergica in *C. elegans*. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di: uno, utilizzare un marcatore appropriato per la selezione durante gli incroci genetici; due, utilizzare maschi sani e L4 di *C. elegans* per gli incroci.

E tre, assicurati di valutare con attenzione e in modo costante i neuroni CEP e DE. Questa procedura ti permetterà di analizzare rapidamente i fattori genetici che potrebbero potenziare o inibire la neurodegenerazione indotta da alpha alpha CLE. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.