Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

Ciao, sono Randall Hoffman, studente laureato nel laboratorio di Susan Linus del dipartimento di biologia del MIT. Oggi vi presenterò l'elettroforesi in gel con detergente semi-denaturante, o SDD-AGE. Il nostro laboratorio utilizza questa tecnica per lo screening di prioni e altre proteine alofeniche.

La nostra versione dell'età SDD è semplice e affidabile e può essere adattata per analizzare un numero qualsiasi di campioni. Gli amiloidi sono eccezionalmente resistenti alla denaturazione da parte di SDS, il che permette di separarli da altre proteine utilizzando la SDDH. Tuttavia, i dati ottenuti con la SDDH non possono da soli essere utilizzati per confermare che una sostanza sia un amiloide.

Per fare ciò, è necessario utilizzare altre tecniche. A tale proposito, permettetemi di mostrarvi. L'S-D-D-H-S-D-D-H può essere eseguita utilizzando apparecchiature standard per l'elettroforesi orizzontale del DNA.

Per prima cosa, è necessario assemblare il vassoio per la colatura del gel. Le dimensioni dell'apparecchiatura dipenderanno dal numero di campioni in possesso. Per un elevato numero di campioni, utilizziamo una lastra di 20 per 24 centimetri e fino a quattro pettini da 50 pozzetti.

Per preparare il gel, saranno necessari agarosio a bassa EEO con forza di gel media o alta, un buffer 1X TAE e una soluzione stock al 10% di SDS. Preparare una soluzione al 1,5% di agarosio e un buffer 1X TAE. È consigliabile rendere il gel il più spesso possibile per poter caricare la maggior quantità di campione e massimizzare il rilevamento. Riscaldare la miscela al microonde fino a quando l'agarosio si sarà completamente disciolto.

Aggiungere rapidamente il 100 XSDS stock allo 0,1% e ruotare per mescolare. Se durante questo passaggio si verifica una solidificazione parziale dell'agarosio, scioglierlo nuovamente su una piastra riscaldata. Fare attenzione a non far bollire la soluzione.

Dopo aver aggiunto l'SDS, poiché la soluzione può facilmente schiumare, versare questa soluzione nel vassoio di colata mentre è ancora calda. Quindi utilizzare un pettine per eliminare eventuali bolle d'aria che potrebbero interferire successivamente durante il trasferimento del gel. Una volta che il gel si è completamente raffreddato e solidificato, rimuovere con cura i pettini e posizionare il gel nel serbatoio.

Immergere completamente il gel in un XTAE con 0,1% di SDS. A questo punto si è pronti per caricare i campioni. I campioni proteici utilizzati nell'SDDH vengono preparati esattamente come in una SDS-PAGE, con due importanti eccezioni.

Prima di tutto, è necessario evitare il riscaldamento dei campioni, che potrebbe denaturare gli aggregati in monomeri proteici. In secondo luogo, prestare attenzione a evitare la degradazione delle proteine. Poiché le condizioni denaturanti utilizzate in questo caso non sono sufficienti ad inattivare tutte le proteasi, si raccomanda di utilizzare almeno il doppio della concentrazione consigliata di un cocktail completo di inibitori delle proteasi.

In questa dimostrazione, utilizzeremo lisati di cellule di lievito che sovraesprimono una particolare proteina di interesse. In genere utilizziamo due ml di colture cresciute durante la notte in blocchi da 96 pozzetti disponibili da VWR, ma quando si analizzano proteine a bassa abbondanza, è necessario utilizzare volumi maggiori di coltura.

Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 2000 RCF per cinque minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante e lavare le cellule risospendendole in acqua e centrifugando nuovamente. Dopo la seconda centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in soluzione di piastramento fresca. I zy nella soluzione digeriscono le pareti cellulari, consentendo di lisare efficientemente le cellule in un piccolo volume di buffer di lisi. Incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius.

Centrifugare le cellule plastiche di riserva a 800 RCF per cinque minuti. Rimuovere completamente il surnatante e risospendere ogni pellet in 100 microlitri di buffer di lisi. Successivamente, coprire il blocco con del nastro e vortexare ad alta velocità per due minuti.

Questo consente a tutte le plastiche delle sfere di lisiare i detriti cellulari a 4.000 RCF per due minuti. Trasferire con attenzione il surnatante in una piastra PCR a 96 pozzetti.

Normalmente analizziamo centinaia di campioni contemporaneamente nel nostro laboratorio, pertanto ci avvaliamo di un sistema per la manipolazione di liquidi. Se desiderato, determinare la concentrazione proteica dei lisati. Successivamente, aggiungere il buffer campione 4x ai campioni per ottenere lisati contenenti buffer campione 1x e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Ora caricare i campioni nel gel. Se desiderato, conservare metà dei campioni per l'analisi SDS-PAGE. Inoltre, caricare marcatori del peso molecolare, inclusi marcatori precolorati e un marcatore con peso molecolare molto elevato, come l'estrazione di flettore di pollo.

Se lo si desidera, è importante mantenere il gel freddo per evitare la diffusione di proteine a basso peso molecolare; pertanto, si consiglia di eseguire l'elettroforesi in stanza fredda. Far correre il gel a bassa tensione, inferiore a tre volt per centimetro di lunghezza del gel. Eseguire l'elettroforesi per diverse ore fino a quando il fronte colorato raggiunge circa un centimetro dalla fine del gel.

Poiché l'amiloide non viene denaturato dal 2% SDS a temperatura ambiente, rimarrà integro mentre altri complessi, inclusa la maggior parte degli aggregati non amiloidi, si dissociano in presenza di 2% SDS. Pertanto, la maggior parte delle proteine sarà monomerica e migrerà rapidamente attraverso il gel, mentre gli amiloidi resistenti all'SDS con alto peso molecolare migreranno più lentamente.

Dopo questa fase, il gel sarà pronto per il trasferimento. Sebbene si possano utilizzare diversi metodi di trasferimento, otteniamo i migliori risultati impiegando il trasferimento capillare. Poiché il trasferimento capillare può accogliere gel di qualsiasi dimensione, è pratico analizzare centinaia di campioni mediante trasferimento capillare.

Una pila di carte filtranti asciutte serve ad aspirare il tampone attraverso il gel, depositando le proteine su una membrana di nitrocellulosa posizionata tra le carte e il gel. Sarà necessario ritagliare un pezzo di nitrocellulosa, ad esempio high bond C, extra, delle stesse dimensioni del gel. Sarà inoltre necessario ritagliare 20 pezzi di carta filtrante GBO oh four e otto pezzi di carta filtrante GBO oh two delle stesse dimensioni del gel.

GB oh quattro è molto spesso e assorbente. Mentre GBO oh due è molto più sottile e ha una trama più fine, il che garantisce un contatto più uniforme con la membrana. Tagliare un pezzo aggiuntivo di GBO oh quattro da utilizzare come stoppino e renderlo largo circa 20 centimetri più del gel immerso.

Il nitroso UL WIC e quattro pezzi di GBO oh due e un XTBS in un contenitore di plastica assemblano una pila di fogli nel modo seguente: 20 pezzi di GBO oh quattro secchi. Poi quattro pezzi di GBO oh due secchi. Poi un pezzo di GBO oh due pre-umettato.

Posizionare la nitrocellulosa in cima a questo stack. Risciacquare brevemente il gel sul vassoio di polimerizzazione in acqua per rimuovere il tampone di corsa in eccesso. Quindi iniziare con attenzione a far scivolare il gel dal vassoio sullo stack, aggiungendo TBS sul gel mentre lo si fa scivolare dal vassoio sulla membrana, se necessario.

Il tampone aggiuntivo aiuta a prevenire che si formino bolle intrappolate nel gel. La pipetta di trasferimento è adatta a questo scopo una volta che il gel è stato completamente spostato sul supporto. Verificare attentamente la presenza di bolle, se presenti.

Sollevare il bordo del gel e riapplicare il tampone fino a quando le bolle non vengono eliminate. Posizionare le rimanenti tre pezze di GBO oh due preriscaldate sulla parte superiore del gel. Assicurare un contatto completo tra tutti gli strati arrotolando con fermezza una pipetta sulla superficie del blocco.

Posizionare due vassoi rialzati contenenti TBS ai lati della pila di trasferimento, quindi disporre il tampone pre-umettato attraverso la pila in modo che ciascuna estremità del tampone sia immersa nel TBS. Coprire l'intera pila di trasferimento con un ulteriore vassoio di plastica al quale aggiungere un peso aggiuntivo, ad esempio una bottiglia da 500 ml piena d'acqua. Il tampone attingerà il tampone dai vassoi e le carte assorbenti asciutte faranno passare il tampone attraverso il gel nell'arco di diverse ore.

Questo farà depositare le proteine sulla membrana; lasciare procedere il trasferimento per almeno tre ore o durante la notte. Al termine del trasferimento capillare, la membrana può essere processata mediante un western blot standard. Qui si osserva una tipica immunoblotting di proteine che sono state sovraespressa in un ceppo di lievito che predispone certe proteine a formare amiloidi.

È possibile osservare chiaramente che alcuni dei nostri candidati formano molto bene specie resistenti all'SDS ad alto peso molecolare o ad amiloide, come quelle mostrate qui e qui. Altri, tuttavia, non formano aggregati e sono completamente monomerici, come questi e questi. Inoltre, si può notare che la dimensione dei polimeri amiloidi varia a seconda della proteina, come si vede in queste due bande.

Abbiamo appena mostrato un metodo semplice per analizzare aggregati ad alto peso molecolare e insolubili, come gli amiloidi di possibili prioni. Speriamo che la nostra presentazione vi sia piaciuta e che troviate utile questa tecnica per lo studio di proteine immunogeniche di tipo Ami. Grazie per averci seguito e buona fortuna nella vostra ricerca.