Immunoprecipitazione DNA metilato

Questo video illustra un protocollo per l'immunoprecipitazione del DNA metilato o MeDIP, un metodo utilizzato per isolare in modo specifico e senza bias il DNA metilato. La metilazione del DNA nei mammiferi è caratterizzata dall'aggiunta di un gruppo metilico alla posizione C5 della citosina.

Quando presente in un dinucleotide CPG, costituisce un marcatore epigenetico reversibile che svolge un ruolo importante nello sviluppo normale, nonché in diversi processi patologici. Le funzioni normali della metilazione del DNA includono l'inattivazione del cromosoma X nelle femmine, il silenziamento degli elementi ripetitivi, l'imprinting genomico e il mantenimento della stabilità genomica. È stato inoltre dimostrato che la metilazione del DNA svolge un ruolo in numerose malattie come il cancro, la sindrome di Prader-Willi, la sindrome di ICF (immunodeficienza, instabilità centromerica e sindrome da anomalie facciali) e la sindrome di Rett.

Nelle neoplasie, ad esempio, l'ipermetilazione anomala dei promotori può portare al silenziamento di geni fondamentali di soppressione tumorale. Mentre un'ipometilazione inadeguata provoca instabilità cromosomica e attivazione degli oncogeni; l'incontro viene effettuato innanzitutto mediante sonicazione del DNA in frammenti di dimensioni comprese tra 300 e 1000 paia di basi. Il DNA sonificato viene quindi denaturato a 95 gradi Celsius.

Si aggiungono anticorpi primari, che riconoscono la cinque prime metazina, e si lasciano legare ai frammenti di DNA metilato. Anticorpi secondari, coniugati a microsferette magnetiche Dyna, vengono utilizzati per isolare i frammenti di DNA legati dall'anticorpo primario. I frammenti non metilati vengono rimossi e gli anticorpi vengono digeriti dalla proteinasi.

La pulizia con fenil cloroformio KA rimuove la proteina digerita e la precipitazione purifica il DNA, che ora risulta arricchito in frammenti metilati. Il DNA ottenuto può essere utilizzato per applicazioni come PCR, microarray e sequenziamento. Il procedimento viene generalmente eseguito in due giorni.

Il primo giorno prevede la preparazione del DNA, la sonica, l'immunoprecipitazione e la digestione proteica. Il secondo giorno prevede l'estrazione con fenolo-cloroformio e la precipitazione con etanolo per purificare e isolare il DNA arricchito per metilazione. Sono necessari alcuni materiali speciali, tra cui provette centrifuga silanizzate, un dispositivo per la sonica del DNA, un anticorpo primario, anti-5-metilcitosina topo, anticorpo monoclonale, anticorpo secondario, perle Dyna legate a anticorpi anti-IgG di pecora e un portaprovette magnetico.

Il primo passaggio del protocollo Meetup è la preparazione del DNA. È fondamentale valutare la natura del DNA in anticipo. È necessario conoscere lo stato del DNA campione, se è principalmente a doppio o a singolo filamento, poiché una quantificazione accurata del campione è di importanza fondamentale e diversi metodi per determinare la quantità di DNA possono essere influenzati negativamente dalla presenza di specie di DNA indesiderate.

La quantità di DNA a doppio filamento può essere valutata facilmente mediante fotometria spettrale utilizzando un NanoDrop 3, caricando 1,5 microlitri e impostando il tipo di misurazione su acido nucleico, selezionando DNA 50 come calcolo e inizializzando lo strumento con 1,5 microlitri di acqua. Pulire i piattelli e azzerare lo strumento con 1,5 microlitri del liquido. Il campione viene disciolto, pulire i piattelli, caricare 1,5 microlitri del campione e premere misura.

La concentrazione verrà indicata e può essere utilizzata. Per calcolare il numero di microlitri necessari per me, immergere un A due 60 a due 80 con un rapporto di 1,8 è ideale in questo caso. Viene preparato un campione di un microgrammo.

Tuttavia, un campione di appena 200 nanogrammi è sufficiente per ottenere risultati soddisfacenti. Per l'analisi, caricare il campione di DNA in una provetta pulita silanizzata. Aggiungere acqua sterile in quantità sufficiente a portare il volume finale a 50 microlitri.

La sonicazione del DNA e l'immunoprecipitazione devono essere eseguite in provette silanizzate per prevenire il legame non specifico di DNA e proteine alle pareti delle provette. Una volta che il DNA è stato preparato, il campione deve essere sottoposto a sonicazione, necessaria per frammentare il DNA poiché l'immunoprecipitazione risulta più efficiente con frammenti di DNA più piccoli; caricare il campione nel sonicatore, assicurarsi che l'impostazione della potenza sia al massimo e che la macchina sia impostata su 30 secondi. Dopo 30 secondi di pausa, riempire la base fino al livello indicato con acqua a quattro gradi Celsius.

Sonicare il campione per sette minuti. Al termine della sonicazione, rimuovere il tubo e metterlo sul ghiaccio. È importante ottimizzare in anticipo le condizioni di sonicazione in base al campione previsto e alle dimensioni del DNA.

Ad esempio, un campione di DNA parzialmente degradato richiederà un tempo di sonica più breve. I prodotti della sonica possono essere visualizzati mediante tecniche elettroforetiche standard. A questo punto, si desiderano frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 300 e 1000 paia di basi per l'uso successivo.

Negli saggi con microarray e PCR, si dovrebbe riservare un quinto del DNA come DNA di input o di riferimento; in questo caso, 800 nanogrammi di DNA sonificato verranno utilizzati per l'immunoprecipitazione e il resto sarà conservato come DNA di riferimento. Il passaggio successivo nel protocollo prevede la reazione di immunoprecipitazione (IP); prima dell'aggiunta dell'anticorpo primario, il DNA deve essere denaturato. La denaturazione è necessaria perché l'anticorpo primario riconosce il DNA a singolo filamento.

Posizionare il campione in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine del passaggio di denaturazione, trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Questo impedirà al DNA denaturato di ripiegarsi nuovamente e permetterà un legame ottimale degli anticorpi una volta che il campione si sarà raffreddato.

Centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il contenuto sul fondo. Successivamente, va aggiunto l'anticorpo primario. La quantità di anticorpo utilizzata deve essere titolata per ogni lotto e per ogni produttore.

In questo caso, aggiungiamo cinque microgrammi di anticorpo primario e quindi aggiungiamo il buffer per immunoprecipitazione o buffer IP fino a un volume finale di 500 microlitri. Successivamente, il DNA per IP viene posto su un agitatore rotante e lasciato incubare a quattro gradi Celsius per due ore. La rotazione è necessaria per evitare la formazione di conglomerati di anticorpi all'interno del tubo durante l'incubazione.

Circa 15 minuti prima del completamento dell'incubazione con l'anticorpo primario, pulire e preparare le perle magnetiche Dyna. Innanzitutto, risospendere completamente le perle nel flacone mediante vortex. Successivamente, trasferire 30 microlitri di perle in una provetta pulita silanizzata e posizionare la provetta su un supporto magnetico per le reazioni multiple.

Trasferire 30 microlitri di perle per reazione, più una quantità sufficiente per una reazione aggiuntiva per compensare eventuali errori di pipettaggio o perdite accidentali di alcune perle. Ad esempio, per otto reazioni, prelevare un quantitativo di perle corrispondente a nove reazioni, ovvero 270 microlitri.

Le perle magnetiche verranno attratte verso la parete del portaprovette magnetico. Attendere due minuti affinché le perle miglino e si depositino in una striscia ben definita sulla parete del tubo. Successivamente, rimuovere e scartare il soprannatante aspirando con attenzione, facendo attenzione a non disturbare le perle sulla parete posteriore con la punta della pipetta.

Sostituire il soprannatante con un volume eccessivo di buffer IP, vortexare e riposizionare il campione sul supporto magnetico per due minuti. Ripetere questo lavaggio un’altra volta e risospendere le perle di lavaggio nel loro volume originale di buffer IP. Recuperare il tubo del campione dal rotatore al termine dell'incubazione.

Per completare l'immunoprecipitazione, aggiungere 30 microlitri di perle pulite alla reazione e riposizionare il tubo su un rotatore per due ore a quattro gradi Celsius. Durante questa incubazione, l'anticorpo secondario, che è anti topo IgG, si legherà all'anticorpo primario di topo. Gli anticorpi anti topo sono coniugati a perle magnetiche dyna, consentendo un facile recupero dei prodotti legati e il successivo passaggio di purificazione.

Al termine dell'incubazione con entrambi gli anticorpi, posizionare il tubo di immunoprecipitazione sul rack magnetico per due minuti. A questo punto, il DNA metilato sarà legato all'anticorpo primario, che a sua volta sarà legato all'anticorpo secondario coniugato con le perle dyna. Rimuovere e scartare il sopranatante e sostituirlo con 500 microlitri di buffer per immunoprecipitazione.

Mescolare il contenuto del tubo e riposizionarlo sul rack per due minuti. Ripetere questo lavaggio con il buffer IP un'altra volta. Dopo aver rimosso il soprannatante dall'ultimo lavaggio Resus, sospendere le perline per l'ultima volta.

In 400 microlitri di tampone di digestione, trattare la reazione con 100 microgrammi di proteinasi K e incubare tutta la notte a 50 gradi Celsius. Il trattamento con proteinasi K è necessario per digerire le proteine anticorpali e qualsiasi proteina residua associata al DNA, consentendo al DNA metilato di essere rilasciato in soluzione. La purificazione del DNA viene eseguita il secondo giorno della procedura; recuperare il tubo di digestione dall'incubatrice.

In una cappa, aggiungere 500 microlitri di fenolo-cloroformio uno a uno a pH 7 al tubo e vortexare accuratamente. Centrifugare il tubo per 10 minuti a 13.000 ×g. Rimuovere con attenzione la fase acquosa superiore dal tubo senza disturbare l'interfaccia né asportare alcuna parte dello strato organico. Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo.

È possibile eseguire una seconda estrazione se l'interfaccia appare torbida. Successivamente, aggiungere un decimo del volume di acetato di sodio tre molar, in questo caso 40 microlitri. Un microlitro di glicogeno può essere utilizzato come vettore per facilitare la purificazione del pellet.

Vortexare il tubo per mescolare il contenuto. Quindi aggiungere due volumi di etanolo al 100%, vortexare e congelare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti dopo il congelamento. Il DNA precipitato viene centrifugato a 13.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Un pellet di DNA si formerà sul fondo del tubo. Rimuovere il tubo dalla centrifuga ed eliminare l'etanolo. Fare attenzione a non disturbare il pellet sul fondo del tubo.

Potrebbe essere necessaria una breve centrifugazione per rimuovere l'etanolo residuo. Per lavare il pellet, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% freddo, vortexare e centrifugare nuovamente per 20 minuti a 13.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Al termine della seconda centrifugazione, rimuovere l'etanolo al 70% con una breve centrifugazione ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta.

Lasciare il tubo in un portatubi con il cappuccio aperto per far asciugare il pellet e permettere all'etanolo residuo di evaporare. Infine, risospendere il pellet contenente solo DNA arricchito per metilazione in 10 microlitri di acqua sterile, lasciando un tempo sufficiente affinché il pellet di DNA si sciolga prima dell'uso. È buona pratica validare l'efficienza del protocolo mediante PCR.

Questo può essere eseguito mediante reazioni di PCR progettate per amplificare prodotti che illustrano in modo differenziale frammenti di DNA metilati e non metilati utilizzando primer per DNA umano normale. La regione di controllo dell'imprinting di H19 può essere utilizzata in combinazione con primer progettati per amplificare una regione del genoma che non è metilata. Esempi di sequenze di primer e condizioni di ciclaggio della PCR sono riportati nel protocollo allegato.

A questo punto, è necessario recuperare il DNA di input o di riferimento che era stato messo da parte all'inizio del protocollo di meetup. Verrà impostato un primo insieme di reazioni PCR utilizzando il DNA di input e un secondo insieme utilizzando il DNA IP arricchito per la metilazione. Se il meetup ha avuto successo, la PCR con il DNA IP produrrà un prodotto amplificato utilizzando i primer specifici per la metilazione e nessun prodotto utilizzando i primer di controllo.

Al contrario, la PCR di input dovrebbe produrre prodotti utilizzando entrambi i primer, poiché contiene sia frammenti metilati che non metilati. I frammenti di DNA possono essere arricchiti per sequenze metilate e utilizzati per numerose applicazioni successive, come il sequenziamento PCR e l'analisi con microarray.

Quando integrata con altre tecniche di biologia molecolare, può essere utilizzata per indagare lo stato di metilazione del DNA in modo specifico per un locus o su scala genomica, al fine di effettuare il profiling della metilazione o studiare l'epigenomica.