Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Il mio nome è Maria e lavoro presso Y Healthcare a NOS in Svezia. Le proteine della superficie cellulare sono spesso coinvolte nella comunicazione tra le cellule e il loro ambiente e sono quindi di particolare interesse nella ricerca, con l'obiettivo di ottenere maggiori informazioni sulle malattie e su altre variazioni biologiche indotte da cambiamenti nell'ambiente cellulare. In questo video vi mostrerò un semplice protocollo di marcatura della superficie cellulare con tecnica "side-eye dodge" e vi permetterà di arricchire visivamente queste proteine a bassa abbondanza senza potenziamento fisico e di studiare le differenze di queste proteine della superficie cellulare mediante la tecnologia.

Se questa tecnologia vi interessa, potete trovare ulteriori informazioni nel manuale 2D. Inoltre, disponiamo di una nota applicativa su questo argomento specifico, scaricabile da job. Nel protocollo di marcatura della superficie cellulare mostrato in alto, le cellule vengono marcate mentre sono ancora integre. Durante il processo di marcatura, il colorante avrà accesso esclusivamente alle proteine di superficie cellulare.

Dopo il passaggio di marcatura, le cellule vengono analizzate per verificare l'etichettatura specifica della superficie cellulare. Il campione marcato è stato frazionato in proteine di membrana e proteine citosoliche. In parallelo è stato preparato un campione non frazionato.

Per confronto, quest'analisi di frazionamento non è necessaria, ma è stata eseguita qui semplicemente per dimostrare che il protocollo per la superficie cellulare è specifico per le proteine di superficie. Abbiamo inoltre eseguito il protocollo standard di marcatura senza dieta ETH, riportato qui sotto: le cellule vengono lisate prima del marcaggio, consentendo in questo modo l'accesso alla marcatura di tutte le proteine cellulari. Dopo il passaggio di marcatura, i campioni vengono sottoposti ad elettroforesi bidimensionale.

Le cellule aderenti vengono staccate utilizzando una procedura non enzimatica per evitare la digestione delle proteine di superficie cellulare bersaglio. In questo protocollo, utilizziamo il raschietto di gomma, ma è anche possibile usare un mezzo di dissociazione cellulare enzimatico; successivamente si conta e si suddivide la sospensione cellulare in aliquote di cinque a dieci milioni di cellule per provetta. Le cellule vengono quindi centrifugate e lavate in H-P-S-S-P-H 7,4 per rimuovere tracce di coltura cellulare.

La contaminazione del mezzo da parte di proteine sieriche e componenti fluorescenti può interferire con la marcatura e il rilevamento. Le cellule in crescita in sospensione vengono direttamente pellettizzate e lavate prima del passaggio di marcatura, successivamente al lavaggio. Il pellet cellulare viene risospeso in 200 microlitri di tampone di marcatura freddo sul ghiaccio contenente HPSS a pH 8,5 e uria uno molare.

Per condizioni di marcatura ottimali delle proteine della superficie cellulare, verificare sempre il pH. Prima della marcatura, abbiamo utilizzato 600 picomol di side-eye per 10 milioni di cellule CHO. Il rapporto ottimale tra side-eye e numero di cellule può variare a seconda del tipo cellulare.

Dato che non conosciamo le concentrazioni esatte delle proteine sulla superficie cellulare, nel manuale sui principi e metodi dell'elettroforesi bidimensionale viene descritto come determinare le condizioni ottimali per la marcatura delle proteine con side eye. Le cellule vengono incubate con side eye D floor, dado minimo, per 20 minuti sul ghiaccio al buio.

Dopo la reazione di marcatura, il colorante non reagito viene inibito aggiungendo 20 microlitri di lisina 10 millimolare. Le cellule marcate vengono ora lavate due volte in tampone HPSS freddo a pH 7,4 per rimuovere l'eccesso di colorante. Non rimarrà quindi alcun colorante libero per un'indesiderata marcatura intracellulare o delle proteine nel passaggio successivo, che consiste nella lisi cellulare.

I proteine sulla superficie cellulare sono ora marcate e le cellule vengono lavate e sono pronte per essere lisate. Il pellet ottenuto dall'ultimo passaggio di lavaggio viene risospeso in 150 microlitri di tampone di lisi freddo contenente sette molar urea, due molar tiourea, 4% CHAPS, trenta millimolari Tris, cinque millimolari acetato di magnesio, pH 8,5, e lasciato sul ghiaccio per almeno un'ora con vorticosi occasionali. I campioni sono ora pronti per la separazione bidimensionale.

Il primo passo per l'elettrolisi consiste nel preparare le strisce IPD per la reidratazione. Preparare la soluzione di reidratazione aggiungendo il tampone IPG corrispondente all'intervallo di pH delle strisce utilizzate, quindi versare la soluzione nella cavità della vaschetta di reidratazione. Rimuovere il film protettivo dalla striscia IPG e posizionare con attenzione le strisce, con il gel essiccato rivolto verso il basso, nella vaschetta di reidratazione contenente la soluzione di reidratazione.

Chiudere il coperchio della scatola IPG e idratare le strisce durante la notte. Nella prima dimensione, la focalizzazione isoelettrica, le proteine vengono separate in base al loro pi. Questo viene eseguito utilizzando l'IPG four three.

I listelli reidratati vengono posizionati nel manifold e l'elettrodo viene montato sulla parte superiore. Sono stati applicati 50 microgrammi di ciascun campione utilizzando i tappi di applicazione del campione. Abbiamo applicato direttamente campioni non frazionati senza frazionamento preliminare oppure abbiamo frazionato i campioni in frazioni di membrana e citosoliche prima dell'applicazione.

Il coperchio viene chiuso per proteggere i campioni fluorescenti dalla luce. Lo strumento è stato programmato secondo le raccomandazioni ed eseguito per tutta la notte. Sono state realizzate grandi gel al 12% lamby utilizzando il sistema adult 12 gel.

È stata aggiunta una soluzione dislocante Coster per evitare gel di acrilato polimerizzati nei tubi. I gel sono stati lasciati polimerizzare tutta la notte a temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo la focalizzazione isoelettrica, le strisce vengono rimosse ed equilibrate in un tampone contenente SDS in due passaggi, utilizzando DTT per ridurre i legami disolfuro dei residui di cisteina, seguita da alchilazione con acetamide per evitare modifiche da parte dell'acrilammide.

I supporti IPG vengono immersi nel buffer di corsa e posizionati con attenzione sulla parte superiore dei grandi gel bidimensionali. Evitare di intrappolare aria tra i supporti e il gel sigillando con una soluzione di agarosio fusa al 2% contenente blu di bromofenolo. I gel sono ora pronti per la separazione nella seconda dimensione SDS-PAGE. Nella seconda dimensione SDS-PAGE.

Le proteine verranno separate in base al peso molecolare e questo viene eseguito con il sistema tonal six. Riempire la camera elettroforetica con tampone di corsa anodico, inserire i gel e riempire il comparto superiore con tampone di corsa catodico. Collegare l'alimentatore secondo le raccomandazioni e far correre la seconda dimensione al riparo dalla luce per circa quattro-cinque ore o fino a quando il fronte colorato raggiunge il fondo del gel.

Dopo l'elettroforesi nella seconda dimensione, le cassette del gel vengono posizionate mediante pinze nell'analizzatore fluorescente Typhoon. È possibile scansionare contemporaneamente due gel e tre canali. Il risultato ottenuto con questa 2D-ELE mostra un'elevata risoluzione delle proteine di membrana nel campione, nonostante siano note alcune limitazioni nella rilevazione delle proteine idrofobe mediante 2D-ELE. I risultati mostrano numerosi nuovi spot marcati sulla superficie cellulare, mostrati in rosso, che non vengono rilevati utilizzando il protocollo di marcatura standard mostrato in verde.

Questi risultati mostrano che il protocollo di marcatura della superficie cellulare è altamente specifico per l'etichettatura delle proteine di superficie cellulare. Poiché vengono marcate esclusivamente le proteine di superficie cellulare, esse sono più facilmente visualizzabili e si evita l'attenuazione causata dalle abbondanti proteine citosoliche. L'immagine fluorescente di gel con frazione di membrana non frazionata o frazione citosolica è mostrata nella parte superiore.

Di seguito è riportata un'immagine dello stesso gel dopo la colorazione con argento. I risultati mostrano l'assenza di marcatura fluorescente delle proteine citosoliche, ma la colorazione con argento dimostra la presenza di proteine nei gel. I risultati mostrano inoltre pattern simili di mappa dei punti tra frazioni non frazionate e frazioni di membrana, dimostrando che non è necessaria una frazionamento preliminare prima dell'elettroforesi bidimensionale, il che rende questo protocollo semplice e pratico.

SI due, SI tre e SCI cinque mostrano schemi di marcatura simili e sono tutti compatibili con il protocollo per la superficie cellulare. È stato condotto un esperimento alimentare utilizzando tutti e tre i side eye DI floor minimal dy per lo studio dell'espressione differenziale delle proteine di superficie cellulare in cellule CHO sottoposte a privazione di siero per durate diverse. I campioni della superficie cellulare CY due di tutti i campioni dell'esperimento sono stati raggruppati e utilizzati come standard interno.

È stato possibile seguire le variazioni differenziali di diverse proteine della superficie cellulare durante il periodo di privazione nutrizionale. Sono state rilevate oltre 18 nuove proteine di membrana mediante il protocollo per la superficie cellulare, che non erano state individuate con il protocollo standard per determinare l'identità delle proteine nel gel preparativo. È stato necessario arricchire con il campione della superficie cellulare per facilitare il riscontro dei punti nel set di dati analitici.

Si ottengono risultati. I risultati mostrano un'elevata risoluzione di un gran numero di proteine della superficie cellulare. Questo protocollo è molto specifico per le proteine della superficie cellulare e non si è osservata alcuna marcatura delle proteine intracellulari.

Con questo metodo, è possibile rilevare un numero maggiore di proteine di superficie cellulare rispetto a un protocollo standard, e come hai già visto, si tratta di un protocollo molto semplice da eseguire. È sufficiente marcare le proteine di superficie cellulare mentre le cellule sono ancora integre ed eseguire direttamente l'elettroforesi bidimensionale senza frazionamento della membrana. Pertanto, questo è un ottimo protocollo per studiare le proteine di superficie cellulare e le differenze tra queste mediante la tecnologia D.