Una tecnica per la raccolta seriale del liquido cerebrospinale dalla Magna Cisterna in Mouse

La procedura inizia con l'anestesia del topo e la preparazione del sito chirurgico. Il topo viene quindi posizionato in posizione prona sullo strumento stereotassico. Viene praticata un'incisione sagittale della cute al di sotto dell'occipite e i tessuti sottocutanei e i muscoli del collo lungo la linea mediana vengono separati in modo ottuso.

Successivamente, la parte posteriore del corpo viene posizionata in modo che il corpo formi un angolo di 135 gradi con la testa fissata; la dura madre del grande corno dello sterno CI viene perforata con la capillare di vetro e il liquido cerebrospinale (CSF) viene raccolto. Dopo il prelievo del CSF, i muscoli vengono riallineati e la cute viene suturata; viene iniettato sottocutaneamente circa un millilitro di soluzione salina 0,9% NACL per prevenire la disidratazione e il topo viene mantenuto al caldo fino al suo recupero. Ciao, mi chiamo Liu del laboratorio della dottoressa Karen Duff presso il Top Institute dell'Università di Columbia.

Oggi vi mostrerò come raccogliere il liquido cerebrospinale dallo spazio cisternale del mouse. Con questa tecnica, possiamo raccogliere campioni seriali di LCS fino a tre volte dallo stesso mouse, con intervalli di due o tre mesi. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnica per determinare i livelli di beta-amiloide o tau nel LCS a diverse età nei nostri modelli murini transgenici della malattia di Alzheimer e correlare questi valori con quelli presenti nel cervello.

Alla fine, siamo interessati al potenziale dei livelli di beta o tau di CSFA come possibili marcatori biologici per la progressione della malattia e anche per le sperimentazioni terapeutiche nei topi. Cominciamo dunque. Per questa procedura, è necessario preparare capillari con una pipetta micropolarizzata.

Le capillari utilizzate qui sono in vetro siliceo BOA B 175 10 di Sutter Instruments; si tirano le capillari su un micropipettatore a fiamma Sutter P 87 con l'indice di calore impostato a 300 e l'indice di pressione impostato a tre 30. La capillare di vetro è lunga cinque centimetri e presenta una punta conica. La punta della capillare viene tagliata con delle forbici in modo che il suo diametro interno sia di circa 0,5 millimetri.

La procedura chirurgica inizia anestetizzando il topo con chetamina 100 milligrammi per chilogrammo e xilazina 10 milligrammi per chilogrammo somministrate per via intraperitoneale; durante l'anestesia, mantenere il topo al caldo in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo aver verificato che l'animale è completamente anestetizzato mediante il riflesso di ritrazione alla pressione sulle dita dei piedi, rasare la regione del collo, quindi posizionare il topo sullo strumento stereotassico, come questo prodotto da David Kink. A contatto diretto con il tappetino riscaldante, inserire una sonda rettale per la misurazione della temperatura in modo che il calore del tappetino possa essere regolato in base alla temperatura corporea del topo.

Fissare la testa con gli adattatori per la testa, detergere la cute del collo con iodopovidone al 10% ed etanolo al 70% per tre volte ed eseguire un'incisione sagittale al di sotto della porzione posteriore della testa o dell'occipite. I passaggi successivi devono essere eseguiti sotto un microscopio da dissezione utilizzando pinze ottuse. Separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli M ventor services e M rectus capita dorsalis major in modo da esporre la dura madre dello sterno magna. Utilizzare correttamente una coppia di micro retrattori per mantenere i muscoli separati.

Infine, posizionare il topo con la testa ad un angolo di 135 gradi rispetto al corpo. Il topo è ora pronto per il prelievo di LCR. Questa tecnica di raccolta del LCR dal forame magno è stata pubblicata in precedenza.

Figura C uno A sotto il microscopio stereoscopico. La dura madre appare come un triangolo rovesciato lucente e trasparente attraverso il quale sono visibili il bulbo midollare e un grosso vaso sanguigno. Arteria dural spinella figura C uno B. È possibile osservare la pulsazione circolatoria del bulbo e dello spazio circostante del liquido cerebrospinale.

Asciugare delicatamente la dura madre con un batuffolo di cotone sterile, quindi inserire la capillare nel midollo spinale attraverso la dura madre lateralmente rispetto all'arteria dorsale spinale. Si avvertirà un cambiamento evidente della resistenza quando la capillare sarà inserita correttamente e il liquido cefalorachidiano (CSF) comincerà a fluire all'interno della capillare stessa. Dopo aver raccolto il CSF, rimuovere con attenzione la capillare e collegarla a una siringa da tre millilitri mediante un tubo di polietilene con diametro interno di un millimetro.

Iniettare il liquido cerebrospinale in una provetta da 0,5 millilitri. Etichettare la provetta e congelarla immediatamente su ghiaccio secco. Una volta congelata, trasferire il liquido cerebrospinale in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

La tecnica di campionamento appena dimostrata è estremamente delicata e consente di prelevare campioni successivi di liquido cerebrospinale dallo stesso topo nell'arco di due o tre mesi. Pertanto, dopo il campionamento, i muscoli del collo e la pelle devono essere riallineati e chiusi con punti di sutura. Dopo aver suturato l'incisione, iniettare circa un millilitro di soluzione salina 0,9%NACL per via sottocutanea per reidratare il topo.

Mantenere il topo riscaldato a circa 37 gradi Celsius fino al suo recupero. Monitorare il peso al primo e al settimo giorno dopo l'intervento chirurgico. Vi ho appena mostrato come prelevare il liquido cerebrospinale dal sistema mag del topo.

Quando si esegue questa procedura, ci sono tre aspetti importanti da ricordare. Primo, posizionare correttamente la testa e il corpo del topo sul telaio stereotassico in modo che l'ator del Cy Magna possa essere esposto il più possibile. Secondo, evitare con attenzione i vasi sanguigni quando si penetra il durometro con la capillare.

Altrimenti, il campione verrà contaminato dal sangue. Infine, ricordarsi di mantenere i topi al caldo durante tutta la procedura per prevenire l'ipotermia. L'ipotermia non è solo dannosa per i topi, ma può anche influenzare significativamente i risultati inducendo una produzione di beta o una relazione di ipofosforilazione tall.

Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.