土壌中の根から放射性に出るカルボキシレートの空間分解サンプリングのためのポリアクリルアミドZrOHハイドロゲル

サマリー

本プロトコルでは、ポリアクリルアミドジルコニウム水酸化水素ゲル(ZrOHハイドロゲル)を、異なる作物発育段階の完全な土壌根から根から浸出するカルボン酸塩を非破壊的かつ現場で採取する方法を詳述します。また、イオンクロマトグラフィー質量分析法(IC-MS)を用いたこれらのカルボン酸塩の局所化マッピングと定量についても概説しています。

要約

土壌で育てられた植物根からの根の浸出物のサンプリングと信頼性の高い定量化は依然として困難です。さらに、根箱栽培の植物根から噴出する7種類のカルボキシレート(アコニ酸、クエン酸、フマー酸、乳酸、マレート、シュウ酸、スクシ酸)のサンプリング、2Dマッピング、定量化のための非破壊手法を開発しました。ここで説明する方法は、ポリアクリルアミドジルコニウム水酸化水素ゲル(ZrOHハイドロゲル)を用い、検査されたカルボン酸塩を全て取り込み、95.3%±3.12%から111%±1.99%の効率で溶出可能です。ZrOHハイドロゲルはカルボキシレートに対して高い結合能力を持ち、溶液のpHやカルボキシレート種によって最大1.82μmol cm^²に達し、通常根圏で得られる濃度よりも高いです。さらに、ZrOHハイドロゲルに結合したカルボン酸は安定しており、分析前に4°Cで数週間保存可能です。用途のために、植物は根系への影響を最小限に抑えて容易にアクセスできる土壌充填のリゾボックスで栽培されます。根から放出されたカルボキシレートを採取するために、ZrOHハイドロゲルを関心領域に24時間慎重に塗布します。ZrOHハイドロゲルを採取した後、マッピングのために切断され、ゲル片はイオンクロマトグラフィー質量分析などの後続分析のために溶出されます。私たちの発見は、ZrOHハイドロゲルが根圏内のカルボキシレート濃度を捕捉・決定するのに効果的であることを示しています。この方法の新規性は、完全な土壌栽培植物根からの根の分泌物を採取できることと、従来の方法(土壌・水耕栽培ハイブリッド方式)が破壊的で単発採取のみを可能にするのに対し、時間分解によるサンプリングが可能であることにあります。最も重要なのは、定量的かつ高解像度のミリメートルスケールの2D画像生成が可能であり、根軸に沿ったカルボキシレートの浸出物や根圏内の空間分布の可視化を容易にすることです。さらに、この方法は成長サイクルのさまざまな段階での根の浸出物のサンプリングを容易にします。

概要

植物の根は様々な化合物を根圏に放出し、その物理的、化学的、生物学^的特性を形成します1.植物が非生物的および生物的ストレスにさらされると、根の浸出が特に引き起こされます。根の分泌物は、実際には栄養素や金属の利用可能性と動員、微生物群集と活動、土壌の集合体の安定性、そして植物の病原体に対する防御に直接的または間接的に影響を与える可能性があります^1,2,3。最も重要な根の浸出物の一つはカルボン酸塩であり、これらは栄養塩の溶解(リン(P)、鉄(Fe)、銅(Cu)、亜鉛(Zn)など)、重金属耐性、そして根圏2,3,4,5の有益微生物の増強に関与しています。

特に、排出されたカルボン酸塩にはクエン酸、乳酸、シュウ酸、マレート、スクシネート、フマル酸塩が含まれます ^6,7,8。例えば、クエン酸塩はFeやアルミニウム(Al)(水素)酸化物に結合したPを動員することでPの獲得に重要な役割を果たします ^7,9。しかし、土壌栽培植物からの根の噴出物を正確にサンプリングし定量化することは、主に未攪乱の土壌根系への物理的アクセスの困難や根の滲出液サンプルの取得の困難さから、依然として実験的な課題となっています^10,11。さらに、浸出した化合物は微生物分解を急速に進め(数分から数時間以内)、^土壌ミネラル表面に強く吸着します^1,10。根の浸出研究におけるさらなる課題は、根を乱したり土壌で育てられた植物を収穫したりするため、時間をかけて浸出物を監視することであり、同じ根を再度評価するのが難しいためです。^1,11。したがって、根の浸出物の正確なサンプリング、定量化、モニタリングには、空間的変動を捉え、植物成長中の繰り返しサンプリングを容易にする技術が必要です11。

本研究では、Tizianiらがクエン酸塩向けに最初に開発した非破壊的現地法を提示^し、現在はさらに改良され、土壌内の土壌で栽培された植物根から噴出する6種類の追加のカルボキシレート(アコニ酸、フマル酸、乳酸、乳酸、マレート、シュウ酸、スクシナ酸)のサンプリング、空間的定在、定量化に応用されています。この方法は、根の浸出物¹³の採取にジルコニウム水酸化物系ポリアクリルアミド水素ゲル(ZrOHハイドロゲル)を使用します。ZrOHハイドロゲルは、容易に溶出できるアニオン(カルボキシル酸を含む)に対して強い結合能力を示します 12,13,14。ZrOHハイドロゲルは、(1) 土壌で育てられた植物の根から、ヒドロゲルを根系に単純に配置することで根カルボン酸塩を採取することを可能にします。(2) 結合したカルボン酸塩を微生物の鉱化から少なくとも6週間効果的に保護すること、(3) ゲルに結合しても根圏内のカルボン酸塩の空間分布が維持されること、(4) カルボン酸塩のミリスケール2次元マッピングを可能にします ¹².

根の分泌物採取の既存の方法は、土壌栽培植物からの土壌技術(根洗浄や土壌水耕栽培ハイブリッド、土壌-根浸出物収集装置(SOIL-REC)装置、マイクロ吸引カップ、フィルターペーパー/寒天シート、浸出トラップ、RHIZOテスト技術)と水耕栽培浸出液採取法のいずれかに分類されます。根洗浄または土壌-水耕栽培ハイブリッドアプローチは、植物全体を土壌から慎重に除去し、根系を洗浄し、サンプリング溶液に浸して根の分泌物¹⁵を採取する方法です。その簡便さから土壌栽培植物の浸出物採取で最もよく使われている方法です。しかし、根を土壌から抽出すると根毛や細い根が失われるリスクがあります。さらに、根の徹底的な清掃が必要であり、これにより根を損傷し、根の浸出物の質や量が損なわれ、時間分解によるサンプ^{リングが不可能}になる^{可能性があります。}SOIL-REC法は、特別に設計されたリゾボックスシステムで植物を育て、根を2つの多孔質ナイロンメッシュ(≤ 30 μm)の間に伸ばし、根の浸^出物を採取するルートエクスプレートを用いて採取^{します。この}方法は根系を保存し、土壌汚染を最小限に抑え、根のエクスプーデートを繰り返し採取できるようにします。しかし、複雑な構成(複製数は少なく)、サンプリングに用いる大体積からの浸出物の希釈が高く、再現性が難しく、⁸回目の複製間で大きな変動があるため、最適化も必要です。

周囲の溶液と平衡化できる小さな樹脂片、寒天ゲルシート、または浸出物を対象の根区間に吸着させる(すなわち、根箱や根窓を利用)^18,19。この方法は時間分解によるサンプリングと局所的な浸出物組成の部分的測定を可能にしますが、空間分解能は低いです。一方で、微生物の鉱化による人工物の影響を受けやすく、取り扱いが厄介です。同様に、溶出トラップは個々の根のセグメントからの浸出物を採取するために用いられます。ここでは、単一の根を水平の側室に閉じ込め、密閉されたパースペックスリングに採取液を収め、局所的に配置されます^。この方法は水耕栽培根と土壌栽培根の両方に適用可能であり、局所的なサン^{プリングを可能にします}。しかし、少量の採集が可能で、時間分解によるサンプリングはほぼ不可能であり、個々の根を分離することは機械的応力を受けやすく、根の代謝や浸出に影響を与える^{可能性があります。マイクロ}吸盤は根圏内の土壌溶液の採取に用いられ、土壌で育てられた根からの現地サンプリング^{を可能にします。しかし}、少量の採集が行われ、採取は部分的に時間分解され、滲出物は吸着や微生物分解を受けやすい¹⁶です。RHIZOテスト技術は、根を小さな円筒形で水耕栽培し、底部に30μmのナイロンメッシュで覆い、土壌ディスクに移すことで根^{と土壌間の}溶質交換^{を可能にします。根}マットをサンプリング溶液に浸すことで、浸出物を採取します。この方法は根や土壌との接触を維持しつつ人工的な成長条件を用います。短期実験に限定され、時間分解サンプリングはありません。これらの方法の中で、空間的な浸出パターンを決定するために使用できるのは樹脂、寒天ゲルシート、フィルターペーパー、浸出トラップ、マイクロ吸盤のみです。

水耕栽培抽出法には、水耕栽培および半水耕栽培技術が含まれます。水耕栽培は根の滲出液を収集する際によく使われる簡単な方法であり、植物を栄養液で育てた後、その代わりにサンプリング溶液(H₂O、CaSO₄、CaCl₂、マイクロパー)を用いて浸出物サンプルを得ます^15,23。この方法はシンプルで、根にかかる機械的応力が最小限です。再現性が高く、必要に応じて無菌性があるため、根の浸出物の品質が向上し、時間分解によるサンプリングが可能になります ^5,16。それでも、これは植物の生理学、形態(例:根毛の発生)、根の^{分泌過程を}変化させる非常に人工的なシステムです^6,15。セミハイドロポニックスでは、植物をガラスビーズ、砂、またはバーミキュライトの上で、継続的に浸透する栄養溶液で栽培し、浸出物を浸透溶液に集めます^8,18。この方法は水耕栽培に比べてやや人工的ではなく、時間分解によるサンプリングが可能です。しかし、このシステムはほぼ完全に水分飽和状態であるため、部分的に嫌気性条件に耐性のある植物が必要です。

他の手法と比較して、ZrOHハイドロゲル法はいくつかの利点を提供します。ZrOHハイドロゲルは、土壌栽培(自然条件に近い環境)で根系への影響を最小限に抑えて根の浸出物を採取でき、植物のライフサイクル中に時間分解されたサンプリングを行い、微生物分解の低減と高いカルボキシレート結合能力により根の浸出物を24時間以上収集することが可能です¹²。さらに、ハイドロゲルのサンプル/保存にバイオサイド(例:マイクロパー、NaN₃)は不要であり、長期的に分析機器に影響を与え化学分析の妨げとなる可能性があります。これはカルボン酸塩がZrOHハイドロゲルに化学的に結合しているためです。さらに、サンプルは分析前に数週間から数ヶ月保存できるため、1^つの実験装置から多くのサンプルを採取でき、これはハイドロゲル^中のZrの抗菌特性によるもの^{と考えられます。}さらに、ZrOHハイドロゲルは根圏内の噴出化合物やその他の陰イオンの2Dミリ分解能マッピングを可能にし、^{根系全体の}サンプリングも^{可能です。}ZrOHハイドロゲルは、従来の方法が通常冷凍庫(-20°C)で保存される大量の量に比べて、冷蔵庫内の保管スペースが4°Cで少なくて済みます。主な制約は、気泡を最小限に抑えた高品質のZrOHハイドロゲルを製造することに慣れること、そしてリゾボックスが人工的な栽培環境であることです。もう一つの制約は、この方法が7つのカルボキシレート(アコニテート、クエン酸塩、フマル酸塩、乳酸、マレート、スクシネート、シュウサレート)¹²、スルホンアミド(スルファジアジン、スルファメタジン、スルファクロロピリダジン、クリンダマイシン)²⁷、および無機陰イオン(硫化物およびP、V-バナジウム、As-ヒ素、セレン、モリブデン、Sb-アンチモンのオキシアニオン)14,26,28,29)に対してのみ開発されていることです。ZrOHハイドロゲルは、リゾスフィア^28、29、30におけるサイオン(Al、Fe、Ca-カルシウム、Mg-マグネシウム、Mn-マンガン、Ni-ニッケル、Zn-亜鉛)の生原サンプリングおよびマッピングにおいて、懸濁粒子試薬であるイミノジアセチン酸と組み合わせて使用されています。

ここでは、土壌成長根系からのカルボキシル酸塩の時間および空間的に分離された現地サンプリングを可能にするZrOHハイドロゲルベースの手法を提供します。根の浸出物のサンプリングや2Dマッピングを含む、ZrOHハイドロゲル技術を用いたリゾボックス実験の詳細な説明を提供します。この実験では、ヒドロゲルの調製、リゾボックス充填、植物の栽培、ハイドロゲルの施布、回収と切断、ヒドロゲルからのカルボキシレートの洗脱および分析、そして2D画像生成が続きます。さらに、イオンクロマトグラフィー質量分析(IC-MS)を用いたカルボキシレート分析などの重要なステップに関するノートも提供しています。

プロトコル

1. ZrOHハイドロゲル製剤

注意:ゲルの調製には汚染を防ぐために清潔な環境と材料が必要です。溶液の調製、ゲルのすがい、品質保証のため水和時には、実験室用グレードIの水(≤18 MΩ·cm)のみを使用してください。ハイドロゲル製製開始前に、有害廃棄物容器(液体および固体)がすでにフムフードに入れられていることを確認してください。ゲルの準備を始める前に、オーブンを約42〜45°Cまで1時間予熱してください。材料および化学物質の詳細は 材料表に記載されています。

1. ガラス組立準備
   1. 10%(w/v)のHNO₃酸浴を、65% HNO₃ 153.8 mLを846.2 mLの実験室グレードI水に、排気フードで加えて準備します。
   2. ガラスプレート(6.1 x 17 cm)、ピンセット、テフロンU字型スペーサー(0.25 mm または 0.4 mm)、プラスチッククリップを酸性浴に少なくとも4時間浸してください。
   3. ガラス板、ピンセット、プラスチッククリップ、テフロンスペーサーを酸性浴から取り出し、実験室グレードIの水で少なくとも3回洗います。その後、層流または洗浄台でしっかりと自然乾燥させます。
      注意:ガラス板はゲル製剤と同じ日に準備し、汚染を減らすために紙で乾燥させないようにしてください。
   4. 「U」字型スペーサーを乾いたガラス板に置き、2つ目のスペーサーを加え、クリップで固定します。ピペッティングを容易にするためにガラス板を約~1mmずらしておきます( 図1A参照)。
   5. ガラス板の組み立て方をフィルムフードの下にきれいなプラスチック箔の上に置き、ジェル溶液をキャストします。
2. ポリアクリルアミドゲル製剤³¹
   1. ゲル溶液:15 mLの薄膜拡散勾配(DGT)ゲル架橋剤と47.5 mLの実験室グレードI水を清潔なプラスチックバイアルで混ぜ、100 mLのゲル溶液を準備し、その後37.5 mLのアクリルアミド溶液(40%)を加えます。各溶液を加える際は、混合物をよくかき混ぜます。ゲル溶液は冷蔵庫(4°C)で少なくとも3か月間保存可能です。
      注意:各溶液の適切な量をピペット・計量し、ビスアクリルアミドを使わないアクリルアミド溶液のみを使用してください。2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸(MES)バッファーに置くと軟らかいゲルが生成されます。
   2. 10%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)溶液を、0.1gのAPSを1gの_H2Oに溶かして調製します。溶液は毎日新鮮に準備し、使用前に完全に溶解していることを確認してください。
   3. 4 mLのゲル溶液と28 μL 10% APSを混ぜ、その後10 μL 99% N,N,N'N'-テトラメチルエンジアミン(TEMED)をクリーンなプラスチックバイアルに加え、ゲルカクテルを準備します。各溶液を加えた後に混合します。混合物は素早く重合するため、最大3ゲル分の溶液を準備できます。使用するプレートやスペーサーのサイズに応じてカクテルの容量を調整できます。
      注意:さまざまな試薬を混ぜる際は気泡や泡立ちを避けてください。
   4. 図1B、C²⁶に示すように、ガラス板組立の中間からゆっくりとゲル混合物をピペットで移します。気泡がある場合は、ガラス組立体を優しく傾けるか、ペンでガラス板を叩いて除去します。
      注意:気泡のないゲルを得るには、傷ついたガラス板の使用を避け、使用後は酸性浴槽で保存し、ポリエチレン袋に入れて保管するのではなく、次回の使用前に洗浄してください。1mLまたは5mLのピペットに小さな先端を付けてゲルを鋳造し、中心からゆっくりと加えて均等に広げるようにし、プレートを45°の角度で傾けます。
   5. 組み立て物を予熱したオーブンに入れ、少なくとも1時間温度を42〜46°Cで保ち、ジェルが完全に固まるように(液体の滴りが出ないようにします)。
   6. 清潔で錆のないカミソリの刃を使い、角から優しく組み立てをこじ開け、実験室グレードIの水(図1D–F)でガラス板からゲルを洗い流します(図1D–F)。ジェルを簡単に取り除くために、数分間水で浸し、その後1リットルの実験用グレードI水入りのビーカーに洗い流します。
      注意:ピンセットでゲルを引っ張るのは避けてください。ゲルがプレートにくっつく恐れがあるため、ゲルの変形を引き起こす可能性があります。重合後、見える気泡は通常ゲル内部ではなくガラス板とガラス板の間に存在し、プレートを取り外すと透明になります。
   7. 水和から24時間以内(できれば調製後2時間間隔で)水を少なくとも3〜4回交換し、残った重合化学物質を洗い流してください。水和中に繰り返し水を交換することで、未反応試薬などの不純物が拡散し、pHが低下してゲル内の電荷蓄積を防ぎます。
   8. ゲルシートがすぐにZrOH沈殿に使われない場合は、実験室のグレードI水(約24時間の短期間)または冷蔵庫で0.01モルの^L-1 NaClまたはNaNO₃ (4°C)に保存してください。これらのゲルはNaClに最大1か月間浸漬してから沈殿します。
      注意:洗浄時の汚染を最小限に抑えるため、重合直後にゲルを沈殿させることを推奨します。
3. ZrOHゲル¹⁴の沈殿
   1. ジルコニウム二塩化物オクタハイドレート(ZrOCl_{2.8H 2}O)3.22gを、250mLのプラスチックビーカー内の実験室グレードI水40mLに溶かします。
   2. 最大4枚のゲルシートを置き、最大100mLまで充填します。または、1.66gのZrOCl 2.8H_2Oを20mLの実験室グレードI水に溶かし、2個のゲルを入れて最大50mLまで充填します。
   3. ジェルシートを少なくとも2時間浸けて、ジェル内のZrが均等に分布するようにしてください。
   4. 各ゲルを、pH 6.7(pH ^L-1 NaOHで調整)で緩衝液を充填した0.05モル^L-1 2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸(MES)100 mLに転移し、沈殿を行います。最初の30〜60秒間、ピンセットで優しくかき混ぜて均一な沈殿を得る。
   5. プレートシェーカーで≤100rpmで40分間優しく振ると、ゼル中にZr(OH)₄ を完全に沈殿させます。
      注意:ジェル同士がくっつくのを防ぐため、ゆっくり振る速度が望ましいです。
   6. ゲルを実験室のグレードIの水に1〜2リットルのビーカーに入れて24時間放置し^、2時間 間隔で水を3^回以上交換します。Cl^- の完全な除去は、洗浄液の導電率を測定するか塩化物試験を行うことで確認できます。
   7. ゲルは0.03モルの^L-1 NaNO₃またはNaClに保存されますが、土壌実験では硝酸塩が土壌微生物活動を迅速に促進し、主要な植物栄養素でもあるため、NaClが好まれます^13,32。
   8. ZrOHハイドロゲルは最大60週間(冷蔵庫で4°Cで保存)試験され、その特性と良好な性能を維持することが示されました(目標値の±10%)³²。
4. ジェルカット
   1. 傷のないアクリル板、ピンセット、そして鋭く錆びないカミソリの刃をきれいにしてください。プレキシガラス板がない場合は、厚くて丈夫なガラス板を使えます。
   2. アクリス板を実験室グレードIの水で湿らせてZrOHハイドロゲルシートを広げやすくします。
   3. ZrOHハイドロゲルシートをピンセットでアクリル板に広げ、気泡が出ない平らな状態にします。シートに穴のある部分を特定してください。切断時にはこれらの部分を避けるべきです。
   4. 鋭いカミソリの刃でZrOHハイドロゲルシートを正確に所定のサイズにカットします。切断後にプレートから水分を取り除くことで切り抜いた部分がはっきり見えます。
      注:2Dマッピングのために側面の識別を容易にするため、ZrOHハイドロゲルの断片を直角の台形に切り、最も長い辺を左上に配置することを推奨します。
   5. ZrOHハイドロゲルは、実験室グレードIの水(短期保存およびゲル塗布直前)または0.03モル^L-1 NaNO₃/NaClで長期保存(>24時間)に保存してください。

2. Rhizobox実験セットアップ

注意:植物は土壌で満たされたリゾボックスで栽培されており、その設計は様々です。水やりを容易にし、均一な水分分布を確保するために、底または背面に穴が開けられたリゾボックスの使用を推奨します( 補足図1参照)。材料や化学物質の詳細は 材料表に記載されています。

1. 根箱充填および水保持容量の測定²⁶
   1. 2mmのふるいで空気乾燥した土壌をふるいにかけ、均質化します。中質土壌の使用を推奨しますが、特定の取り扱い技術(例:根箱型、充填、開口、水やり)が用いられれば、砂質や粘土質の土壌も使用可能です。
   2. ライゾボックス内の全ての成分(空)とクランプ、アルミホイルを合わせて重量を記録します(補 足図2C参照)。水分保持能力(WHC)を決定するために必要な数に、さらに2〜3個のライゾボックスを追加します。
   3. リゾボックスを満たすために必要な乾燥土壌の質量を推定してください。一般的に、リゾボックスは上部より最大2cmまで満たされます。推奨されるバルク密度は約1.0〜1.4 g ^cm-3です。
   4. リゾボックスの種類や取り扱いの利便性に応じて、乾燥した土を慎重にリゾボックスに詰めてください。充填中およびその後、土を圧縮せずに平らな板で平らにすることができます。やや湿った土をリゾボックスに充填することもでき、特に細かい質感や重粘土質土壌では土壌構造を維持します(詳細な説明はWagnerら²⁶ 参照)。
   5. あるいは、上からリゾボックスに詰められた場合は、プラスチックホイルをリゾボックスに固定し、前面のプレートで覆い、クランプで固定します( 補足図2A–D参照)。
   6. 利便性の上、充填過程で核孔膜を設置し、表面に平らに置くようにしてください。根の滲出物を採取する際に核孔膜が必要です。
   7. クランプとともに、土で満たされたリゾボックスの重量を記録します。空のリゾボックスの重さを土で満たしたものから引いて、各リゾボックスの乾燥土(mの_乾燥土)の質量を計算し、その重さを記録します。
   8. 水分保持能力は、まずリゾボックスを脱イオン水で飽和させ、その後~8時間排水させることで決定されます。リゾボックスを計量し、ステップ2.1.7で記録された土壌充填リゾボックスの重量を現在の重量から差し引いて水の質量(_mw)を計算します。次に、_mwを_{mの乾燥土壌}で割ってWHC(^g-1)を求め、その結果は比率となります。
      注意: 実際のマッピングにはWHC測定用のリゾボックスを使用しないでください。水分飽和は嫌気性を引き起こし、酸化還元アーティファクトを引き起こす可能性があります。
   9. ほとんどの植物の成長中の最適な水分含有量は、土壌の種類や植物種に応じて50%〜60% WHC(すなわちWHC係数、f_WHC = 0.5−0.6)に維持すべきです。各根箱に加えるべき水量(m_{w add})は以下の通り推定します:m_{w add} = WHC x f_{WHC x} m_{乾燥土壌。}
   10. 植える前にリゾボックスに水をやってください。穴から水やりする場合は、表面に5〜10mLの水を加えてください。
   11. 植物の成長中に植物に水をやるために必要な水やりのリゾボックスの質量を記録してください。
2. 植物栽培と管理^12,26
   1. 発芽や植え付けの前に種子を滅菌してください。一般的な方法は、菌類の増殖を防ぐために70%エタノールに3分間浸し、その後1%ナクラウロに15分間浸すことです。その後、脱イオン水で種子を約6〜7回洗い流します。
   2. 種子は濾紙や発芽ロールで水または0.05 mmol L⁻¹ CaSO₄ で湿らせて発芽させ、根が出るまで行います。
   3. 各根茎箱に苗を1本ずつ移し、前のプレートの近くに置き、少し土をまぶしてから水を足します。
   4. 根箱をアルホイルで包み、根圏内の光化学的還元を防ぎ、藻類やその他の光合成微生物の増殖を防ぎ、光に当たった際に根に負担をかけるのを防ぎます。あるいは、光を通さない黒い前面プレートもあり、アルミホイルの代わりに使用できます。
   5. 根箱をラックに置き、成長室や温室内で温度、相対湿度、光強度を管理して傾けます。傾きは25°〜35°を推奨します。
   6. 植物の需要に応じて、週に少なくとも2〜3回は重力計的に水やりを行います。これは、ステップ1.2.11で記録された重量との差を補うためにリゾボックスの重さを量り、水を加えることで行われます。しかし、植物のバイオマスが大きく水需要が増加した場合は、バイオマスを考慮し、それに応じて水の量を調整します。
   7. 特定の作物管理(例:肥料)は、実験環境、土壌特性、栽培植物種、植物成長中の病害害虫防除の必要性に応じて実施されます。
   8. 生育期間や根の滲出物の採取は、根箱の大きさ、植物種、研究の目的に大きく依存します。

3. 根の滲出物サンプリング ^12,26

注意:ここでは根の滲出物の非破壊サンプリングの詳細を記載しています。必要な材料はすべてサンプリング前に準備され、実験用ブランクもサンプリング中に含まれていることを確認してください。材料および化学物質の詳細は 材料表に記載されています。

1. 採取の少なくとも2時間前、1日または少なくとも2時間前に、根箱の水分含有量を90%−95% WHC(酸素ストレスに敏感な作物は80%)にゆっくりと調整します。これは、まずステップ2.1.9で90%−95% WHCを用いて追加すべき水量(_mw加算)を計算し、その後根箱の総重量、湿った土壌、植物重量の推定値を再計算することで正確に達成できます。天秤を使い、根箱が再計算重量に達するまで脱イオン水を加えます。
2. リゾボックスからアル箔を包み、注目の領域を特定して前面プレートに描きます。この工程は根のセグメントや若い植物のみを採取する場合に限り必要です。
3. プラスチック箔とZrOHハイドロゲル(ステップ1.3参照)を、関心のある部位とリゾボックスのサイズに応じて指定された寸法に切り出します。充填過程で核膜が設置されていなければ、ZrOHハイドロゲルよりやや大きい、希望の寸法にカットしてください。
4. 根箱を取り外し可能な前面プレートを上に向けて平らなスタンドに置き、慎重に開けてください( 図2A参照)。根や土が乱されないようにしながら、ゆっくりとプラスチックホイルを剥がしてください。
5. 関心のある領域に定規を配置し、高解像度の写真を撮影します。これは後のデータ処理に必要となります。定規は、特に多くの根箱をサンプリングする必要がある場合、処理中に画像から正確なサイズを決定するための基準となります。
6. 標的根に少量の水を加え、表面に薄い水膜が現れるまで( 図2B参照)。土壌の水分含有量(望ましい90%–95%のWHC、または酸素ストレスに敏感な作物では80%)が、サンプリング中の土壌とゲルの良好な接触を促進します。分子がハイドロゲルに一定の流れを保つためには、より高い含水率が必要です。
7. 事前に切り出された核孔膜を、関心のある土壌表面・根部に直接置き、土壌と根の界面に平らに置くようにしてください( 図2C参照)。
8. ZrOHハイドロゲルを関心のある核孔膜に直接、できるだけ平らに置き、ZrOHハイドロゲルの左側に置いた定規と一緒に写真を撮ります( 図2D参照)。定規はZrOHハイドロゲルのサイズを測定し、サンプリング中に性質に変化があった場合はサンプル面積を把握し、長期間保存(>1年)で側面を特定するのに役立ちます。
9. ZrOHハイドロゲルを前面プレートから保護するには、ZrOHハイドロゲルの上にプラスチック箔を敷きます( 図2D参照)。
10. ZrOHハイドロゲルの動きを減らすために、リゾボックスを優しく閉じます。リゾボックスを閉じる際のZrOHハイドロゲルの動きを最小限に抑えるために、ゲルサンドイッチ(核孔膜+ZrOHハイドロゲル+プラスチックホイル)をビニール電気テープでリゾボックスのきれいな前面プレートに取り付けることも可能です。これはWagnerら²⁶による記述です。
11. 再びアルホイルでリゾボックスを包み、再び成長室/温室で24時間保管します。根の分泌物は、ゲルが乾燥しなければ、実験環境や研究目的に応じて長期間または短期間採取できます。
12. 塗布期間終了後、リゾボックスを優しく開け、テープと膜を慎重に外し、ハイドロゲルを取り出します。ハイドロゲルを滅菌気密バッグに入れ、閉じる前に数滴の水を加え、分析が終わるまで冷蔵庫(4°C)で保存します。ブランクゲルは対照群と同様に保存してください。2Dマッピングのため、ZrOHハイドロゲルをプラスチックシートと一緒に持ち上げ、上部にマーキングします。
13. 根を除去し、根の形態パラメータ、新鮮な重さ、乾重を決定し、時間分解実験が行われない場合は滲出データの正規化を行います。
14. 時間解析が行われる場合は、リゾボックスを閉じて気候室や温室に戻してください。

4. カルボキシレートの洗脱と測定¹²

注意:ブランクおよび標準品の準備には、新鮮な実験室用グレードI水と高純度の分析基準が必要です。品質保証として、認証済み品質管理基準を使用するべきです。分析前に0.2μmまたは0.45μmのナイロンフィルターで試料をろ過し、チューブの詰まりを防ぐために溶液(試料および標準物質)に粒子が含まれていないことを確認します。材料および化学物質の詳細は 材料表に記載されています。

1. 冷蔵庫から充填済みおよび空白のZrOHハイドロゲルを取り出し、定規で寸法を測定し、0.25mmスペーサーなら0.4mm、0.4mmスペーサーなら0.64mmの厚さでそれぞれの体積を計算します。2Dマッピングでは、清潔なカミソリの刃でZrOHハイドロゲルを希望のサイズにカットしてください。小さい部分の切断や適切な洗出量の扱いが難しいため、下限は約2×2mmであることを覚えておいてください。
   注意:定規の代わりに、切断に使うプレキシガラス板の片側に方行用紙(ミリグラフペーパー)を貼り、ZrOHハイドロゲルをほぼ完璧な塊に切りやすくします。ZrOHハイドロゲルの厚さはバーニアキャリパーで確認されました。
2. ZrOHハイドロゲルまたはZrOHハイドロゲルの断片をプラスチックバイアルに入れ、0.5モルの^L-1 NaOHを0.196^cmの 溶出液/3 ZrOHハイドロゲルの比率で加え、プレートシェーカーで150rpmで24時間振って洗い出します。
3. 非常に小さな(例:2×2 mm)のZrOHハイドロゲル断片で洗脱体積が低い場合は、カルボキシレート定量に用いられる分析法に必要な最小体積に応じて、重量比で実験室グレードIの水を加えて45〜60 μLにします(例えば、IC-MSは機器によりますがオートサンプラー用に最低45 μLのサンプルが必要です)。希釈係数や実際の濃度計算に必要となるため、体積を45〜60 μLにするために必要な正確な水の量を記録してください。
4. 試料(0.2μmまたは0.45μmのナイロンフィルター)をろ過し、バイアルに移します。1.5mLのプラスチックICバイアルの使用を推奨します。凍結しても破損しにくいためです。330μLバイアルは小容量にも使用できますが、気泡が存在しないよう注意が必要です。
5. 選出溶液中のカルボキシル酸を、推奨する分析方法(例:IC-MS、HPLC)で定量します。ICとMS検出を組み合わせて分離することを推奨します。または、高性能または超高性能液体クロマトグラフィー(HPLCまたはUHPLC)を、高度なMS(例:飛行時間測定器やOrbitrap)や分光光度検出器など、さまざまな検出器と組み合わせて使用することも可能です。
6. 測定終了後、サンプルと標準物質は冷凍庫に保管できます。カルボキシル酸を含むすべての溶液は、最大1年間-20°Cで保存することを推奨します。1年以上の保管期間については、品質チェックのために新しい標準物質を準備・測定することができます。
7. ルオ酸塩の総体積中の各カルボキシレートの総量(すなわちNaOH体積+ハイドロゲル体積+添加水)を計算し、根重または根面積で正規化し、洗脱効率係数を掛けます:アコニテート0.94、クエン酸1.00、フマル酸0.90、乳酸1.02、マレート1.05、シュキサレート0.91、スクシネート1.00( 補足表1参照)。希釈係数が選出および測定時に行われた場合は必ず考慮してください。

5. 2次元マッピング

注:浸出データの2D画像を作成する専用ソフトウェアはありません。マッピングはMicrosoft ExcelとPythonで行えます。

結果

ZrOHハイドロゲル法は、もともと土壌栽培植物根からシエン酸をサンプリングするために開発され、¹¹の浸出物の空間的分布を解消するために成功裏に用いられました。この方法を他のカルボキシレートに採用する前に、ZrOHハイドロゲルが他のカルボキシレートとも適合しているかを特性評価しました(補足表1参照)。さらに、2019年に実施されたリゾボックス実験から蓄積されたロードZrOHハイドロゲルを溶出・解析しました。ZrOHハイドロゲルは、Tizianiらが定めた¹²(1 mL, 0.5 mol ^L-1 NaOH)と同じ洗脱パラメータを用いて、アコニ酸、シナイト酸、フマル酸、乳酸、マレート、シュウ酸、スクシン酸に対して、5時間(~0.2 μmol、10 mL)以内に負荷量の100%を吸収できます。ZrOHハイドロゲルは最大3.29 μmol ^cm-2±0.40 μmol cm-2のカルボキシル酸塩に結合でき、通常根圏で見られる(多くはnmol範囲)よりもはるかに高い濃度です。さらに、カルボキシレートを含んだZrOHハイドロゲルは安定しており、分析前に数週間保存できるため、サンプリング中および後の微生物分解を最小限に抑えます。

図3の結果は、P欠乏土壌で栽培された土壌栽培のルピヌス・アルバスL(ルピナス)植物のクラスター根に沿ったシトレートの噴出物の空間分布を2次元で可視化しています。このマップは、2019年8月のシトレートサンプリング後、ZrOHゲルを2025年8月に区切分けした5×2 mmゲル片上で行われた48件の個別測定で構成されています。明らかに、ZrOHハイドロゲルは浸出したクエン酸塩を効果的に吸収し、小型ゲル(0.10 cm²)でも、エリュートの前濃縮を必要とせずに定量的な結果が得られました。最も高いクエン酸塩の浸出率はクラスター根領域(最大2.8 nmol ^cm-2 gel ^h-1)で見られ、¹日目には67.2 nmol ^cm-2のゲルに相当し、最も低い濃度は土壌に接触したゲル片で観察されました。クラスター根の長さは0.2 mmから15.6 mmまで幅があり、全長は250 mmでした。これらの結果は、ヒドロゲルが根放出によるカルボキシレートサンプリングに24時間適していることを確認しています。ZrOHハイドロゲルは、クエン酸塩に加えて、乳酸、フマル酸、マレート、シュウ酸など他のカルボキシレートとも結合することができました(表1)。ZrOHハイドロゲルから6年間4°Cで保存されたほとんどのカルボキシル酸が検出されたことは、カルボキシル酸の分解が最小限であることを示唆しています。しかし、異なる植物種から検出された7種類のカルボン酸について、さらに多くの情報を集めるための実験が進行中です。

図1: ポリアクリルアミドゲルの準備の重要なステップ。(A) ガラス板アセンブリの位置合わせ(約1mmのオフセット)。(B) ゲル鋳造および (C) プレート中心からゲル溶液を均一に広げること。(D) 角からカミソリの刃を使ってガラス板をレバーに持ち上げる。(E) ガラス板から外すためにゲルを浸す。(F) ゲルをビーカーに洗い流す。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2: ZrOHハイドロゲルを用いた根箱栽培植物根系の根部からの根の滲出物採取。(A)前面プレートとプラスチックを取り外した後、リゾボックスを開ける。(B)洗浄ボトル内の脱イオン水を用いた土壌-根の界面を適切に湿らせる。(C)湿った土壌-根の界面に取り付けられた核孔トラックエッチ膜。(D)関心領域にZrOHハイドロゲルを塗布し、前面プレートに対するジェル保護のためにプラスチックホイルで覆われたリゾボックス。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ZrOHハイドロゲルを用いた根の滲出物採取およびシトレート浸出のミリスケール2次元画像。 (A) マッピング用のグリッド作成のために、関心のある根領域に重ねたZrOHハイドロゲルの写真。(B) リン不足土壌で育つ白いルピヌス・アルバスL.(ルピン)クラスター根の分布を示すシトレート浸出率の分布を示すミリ波スケールの2D画像。各グリッドは5×2 mmのゲル片を表しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

工場	治療	アコニタテ	クエン酸塩	フマーレート	乳酸	マラテ	シュウ酸	サシネート
	mg P kg-1 土壌	NMOL CM-2 H-1
ルパン	50		0.02	0.21	0.15		0.06
ルパン	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
ルパン	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
ルパン	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
ライス(DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
ライス(DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
ライス(ネリカ4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

表1:0、50、250 mg P ^kg-1土壌に作用した場合の、土壌栽培のLupinus albus L.(ルピン)およびOryza sativa L.(稲)のアコニテート、クエン酸塩、フマル酸塩、乳酸酸塩、マレート、シュウ酸塩、シュク酸塩の分泌率。LOQは定量の限界です

補足表1:7つのカルボキシレートに対するZrOHハイドロゲルの洗脱パラメータ(1 mL、0.5 mol ^L-1)および容量(溶出効率および補正係数)。データは平均の標準偏差±平均値(個々のカルボキシレートの洗脱効率と容量はn=4、カルボキシレート混合物はn=40)です。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図1:水やりを容易にするための推奨リゾボックスの概略図。リゾボックスは、底部と背面に均等に配置された水飲み穴を備えたリゾボックスフレームと、実験中の根の成長監視用の取り外し可能な透明な前面プレートで構成されています。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:Rhizoboxの組み立ておよび土壌充填工程。 (A)Rhizoboxフレームの裏側の穴を粘着テープで覆います。(B)Rhizozboxフレームの前面または開口側に(核孔膜)、その後プラスチックホイルを貼り付けます(十分にきつく平らであることを確認してください)。(C)前面プレートを設置し、ライゾボックスをクランプします。(D)リゾボックスを前方に傾けて、細かい粒子が取り外し可能な表面に落ちるようにして、写真のように滑らかな表面にします。(E) または、開口側から覆われたリゾボックスフレーム(A)を充填し、取り外し可能なプレートで水平にし、その後核孔膜、プラスチックホイル、前面プレートで覆う。(F) 最終セットアップ、水やりと植え付け。代替の充填手順はWagnerら(2020)に示されている。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル1: このファイルには、ヒートマップを生成するために使用されたRスクリプトの詳細が含まれています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するカルボキシレートサンプリング法はZrOHハイドロゲルを用いており、適切なゲルの調製と取り扱いが不可欠です。ZrOHハイドロゲルを扱う際は、数滴の実験室用水で湿った状態に保つことを推奨します。調製時には、ゲル混合物を準備した後(ステップ1.1.3)、迅速にゲルを鋳造し、ガラス板間に気泡が形成されないようにすることが重要です。特にZrOHハイドロゲルの中心部にある気泡は、サンプリングの妨げになるため重要です。一方、塗布前にゲルをトリミングすることで端の気泡を除去できます。さらに、根から放出されたカルボン酸塩はハイドロゲル内の沈殿したZrOHに結合するため、沈殿時に均等に分布するZrが不可欠です。ゲル内のZr分布が不均一であると、カルボキシル酸の横方向拡散を引き起こし、空間分布を歪め、2次元局^在化の信頼性を損なう可能性があります。Zrの均等分布は、ポリアクリルアミドゲルをZrOCl₂·8H_2O溶液に2時間以上浸け、より広いビーカーに浸漬し、ゲル数を減らすことで達成^{できます(ステップ} 1.2.3)。さらに、Zr分布はZrOHハイドロゲルを開発したGuanら¹⁴が推奨した走査型電子顕微鏡(SEM, S-3400N II、日立・日本)を用いて検証可能です。しかし、SEMは巨大なサンプルに対して標準的な手法としては実現できません。

もう一つの重要なステップは、カルボキシレートサンプリングのためのリゾボックス充填、核孔膜の塗布、ゲル塗布前の水やりです。砂質または重質粘土質土壌の充填および取り扱いには、均一に滑らかな表面を確保するために特に注意が必要です。これは適切なゲル接触と排水の良好な環境を維持するために不可欠です。滑らかな表面は核孔膜の適切な接続にも不可欠です。核孔膜が土壌表面に正しく付着し、気泡を最小限に抑えることで、根とZrOHハイドロゲルの間に良好な接触を確立することが重要です。ZrOHゲル塗布前には、土壌を適切に飽和させ、ZrOHハイドロゲルがしっかりと接着し、平らに保ち、湿った状態を保ち、サンプリング中にその完全性を保つことが重要です。2次元カルボキシレートマッピングのためにゲルを切断する際、ミリメートル単位の正確な切断を達成するのは難しい場合があります。したがって、2×2 mm未満の解像度は推奨しません。さらに、ゲルは乾燥時に収縮するため、採取後は完全性を保つために湿らせておくことが重要です(ステップ3.12)。現在の方法は、カルボキシレートの分解を防ぐために微生物阻害剤として_NaN3を使用することを推奨したTizianiら¹²から応用されています。このプロトコルでは、根の浸出物(NaN₃またはAgCl3ベースの材料であるMicropur)のサンプリングに一般的に使われる微生物阻害剤²³は、分析手法への干渉やIC-MS系への潜在的な影響のため、使用しません。

これまでのところ、この方法は7種類のカルボン酸(アコニ酸、クエン酸、フマル酸、乳酸、マレート、シュウ酸、スクシナ酸)のみで検証されており、根のエスドームは複雑な化合物混合物(例:フェノール酸、アミノ酸、炭水化物、カルボキシレート)で構成されています。これらの他の重要な化合物は現在この方法で考慮されておらず、ZrOHハイドロゲルもそのサンプリングで特徴付けられていません。土壌中の他のオキシアニオン(リン酸塩、硝酸塩など)の存在は、カルボキシレートの取り込み、容量、溶解、さらにICやHPLCでのカルボキシレート定量に影響を与える可能性があります。さらに、大型植物(例:樹木や低木)から非常に大きな全根系をサンプリングすることは、非常に大きなZrOHハイドロゲル(>30 cm)の生成が困難であるため非常に困難です。しかし、これは現在のすべての浸出物サンプ^{リング技術で}問題となっています8。さらに制限はリゾボックスの使用です。リゾボックスでの植物成長は水耕栽培システムよりもはるかに現実的^{ですが8は}依然として人工的な構造であり、^根の発達のための三次元空間が限られています。さらに、サンプリングは2次元表面で行われるため、理論的にはゲルに接触しない方向に放出されたカルボキシレートの損失を引き起こす可能性があります。しかし、この制約は拡散、カルボキシレートに対するZrOHハイドロゲルの結合能力の向上、施布中の根圏土壌の高い水分量によって緩和可能です。しかし、これらの側面を明らかにするにはさらなる検証が必要です。

根から放出されたカルボン酸塩を採取するZrOHハイドロゲル法は、一般的に使われている方法(すなわち土壌-水耕栽培ハイブリッドや水耕栽培法)に比べていくつかの利点があります。この新しい手法により、攪乱されていない土壌の根系からのカルボン酸塩の現地サンプリング、時間分解によるサンプリング(Santner, Mühlbacherら、未発表データ)、およびミリメートルスケールの2Dマッピングが可能になります。さらに、ZrOHハイドロゲルは根に対して少なくとも24時間¹²時間使用可能です。また、同じ根セグメントをより長期間にわたって繰り返しサンプリングすることも可能であるはずです。この方法は、フィルターペーパーの適用などの類似手法よりもはるかに発展し、特徴付けが格段に高まり^ます。ZrOHハイドロゲルはカルボキシレートの高いゲル容量により長時間のサンプリングが可能です。例えば、マラートの最低^ゲルは0.44 μmol cm^²± pH 4.00のスクシネ^ートは1.66 μmol ^cm²±0.10 μmol cm⁻2で、カルボキシレートを混合すると合計3.29 μmol ^cm²±0.40 μmol cm⁻²となります(補足表1参照)。土壌・水耕ハイブリッド法では根洗浄の工程(通常1株あたり20〜30分かかる)を省略することで、根系の損傷やそれに伴うバイアスが大幅に減り、より現実的で代表的なデータが得られます。

特筆すべきは、ロードされたZrOHハイドロゲルは特別な保管条件を必要とせず、冷蔵のみで済み、これまでの応用では浸出後の前濃縮は必要なかったことです。ZrOHハイドロゲルは他のアニオンとも結合し、同じ条件下で溶出され、IC^14,34で解析可能です。これにより、カルボキシレートの浸出を根圏内の栄養素の空間分布と結びつけること^{が可能になります。}

結論として、根放出されたカルボキシル酸塩をサンプリングするこの新しいアプローチは、根圏研究の基本的なステップです。カルボン酸は植物栄養素(例:P、Fe)^35,36の動員と獲得、さらに有益微生物の導入において重要な役割を果たしているため、この方法は根の形質や植物育種のスクリーニングに用いられます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール	シグマ・オルドリッチ		70%
シュウ酸	シグマ・オルドリッチ	194131-250G	98%
トランスアコニティック酸	シグマ・オルドリッチ	122750-25G	98%
ジルコニウム二塩酸化物オクタハイドレート(ZrOCl2 & times2O、98%)	サーモ・サイエンティフィック	A12342.22	98%
クエン酸	シグマ・オルドリッチ	C83155-500G	99%
硝酸ナトリウム	VWRケミカルズ	ロット番号:19H224150	100%
硝酸(HNO3、3)	シグマ・オルドリッチ	CAS番号:7697-37-2	>65%が分析に値します EMSURE®リーグ。Ph Eur,ISO
フマー酸	シグマ・オルドリッチ	240745-100G	>99%
水酸化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S8045-500G	≥98%
過硫酸アンモニウム(APS_(NH4)2S2O8)	サーモ・サイエンティフィック	201531000	≥98.0%、超純度、電気泳動用
スクシン酸	シグマ・オルドリッチ	S3674-100G	≥99%
2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸(MES)バッファー	シグマ・オルドリッチ	M8250-250G	≥99.5%
塩化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	71376-1KG	≥99.5%
架橋剤	DGTリサーチ社(ランカスター、イギリス)	な	2%、アガロース誘導体
プレートシェーカーまたは水平シェーカー			Any
イオンクロマトグラフィーまたはIC-MS	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	な	高性能または超高性能の液体クロマトグラフィー(HPLCまたはUHPLC)は、高度なMS(例:飛行時間測定やオービトラップ)や分光光度検出器など、さまざまな検出器と組み合わせて使用可能です
pHメーター			任意の実験室用pH電極を使用できます
オーブン	バインダー	な	特定の温度を保つ小型オーブンなら何でも使えますが、できれば小さいものが望ましいです。
ナイロンfilters_13 mm 0.45 & マイクロ;M	GVSフィルター技術	ロット番号:7135431	より大きなナイロンフィルターも使えますが、エリュートの量が小さいため小さい方が好まれます。
硫酸カルシウム二水和物	シグマ・オルドリッチ	C3771-1KG / CAS-No: 10101-41-4	CaSO4も使用可能です。
アクリルアミド溶液、40%	G-バイオサイエンス	786-508	混合されたアクリルアミド溶液は使わないでください。ビスアクリルアミド。有害な化合物で、煙の中には注意して取り扱うべきです。
リゾボックス	https://www.rhizosphere.com/	な	当社のリゾボックスは Rhizosphere.com のデザインに基づいてカスタムメイドされています
ポリプロピレンバイアルキット、1.5 mL	サーモ・サイエンティフィック	79812	プラスチック製ICバイアルは冷凍保存が可能で、割れずに使えるため好ましいです。330 & マイクロ;Lも使えますが、気泡が入らないように注意が必要です
シスアコニティック酸	サーモ・サイエンティフィック	A16010.06	技術 85%
N,N,N',N'- テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	シグマ・オルドリッチ	ロット番号:BCBN1173V	慎重に扱うべき有毒化合物
250 mL PPバイアル	サーステット	ロット番号:2406082
アルミニウム箔	地元のスーパーマーケット	な
Beakers_1 L/2L
クランプ	地元の倉庫	な
ガラス板(6.1 x 17 x 0.4 cm)	地元の倉庫	な
L-(-)-マリン酸	シグマ・オルドリッチ	M6413-25G
ICの乳酸標準	シグマ・オルドリッチ	07096-100ML
層流ベンチ
L-乳酸無水	サーモ・サイエンティフィック	L13242.14
核孔トラックエッチングMembrane_0.2および微小;m	シチバ	ロット番号:A29983896
ビニールホイル/ビニール袋	地元の倉庫	な
プラスチックピンセット	セマデニ	602
プレキシガラス板	地元の倉庫	な
PP 30 mLバイアル	アプタカ温泉	ロット番号:250552
PTFE spacer_0.25/0.4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
カミソリの刃	地元の倉庫	な
支配者	地元の書店	な
次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)	カルロ・エルバ 試薬	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 mL	ヘンケ・サス・ウルフ(ヘンケ・ジェット)	ロット番号:22A17C8
ビニール電気テープ	地元の倉庫	な