空間トランスクリプトームデータ解析の実践的ワークフロー：データ取得から高度な解析まで

サマリー

本プロトコルでは、空間トランスクリプトームデータの解析に向けた再現可能なワークフローを提示します。公開データの取得から、Seuratを用いた品質管理、データの統合、空間的特徴の検出、細胞型のデコンボリューション、関心領域（ROI）のアノテーション、そして細胞間相互作用の解析に至るまでの手順を、透明性のある実行を支援する実用的なチェックポイントと共に解説します。

要約

空間的トランスクリプトーム解析（ST）は、組織切片内におけるmRNA分子の2次元的な空間的コンテクストを保持したままゲノムワイドな遺伝子発現をプロファイリングする手法であり、組織構造や微小環境に関連する生物学的研究を可能にします。しかし、データのインポート、品質管理、統合、デコンボリューション（逆畳み込み）、空間統計、および可視化には、多くの場合、複数のソフトウェア環境と再現可能なパラメータ選択が必要となるため、ST解析は依然として困難な課題となっています。本プロトコルでは、公開STデータセットを用いたRでの実用的な計算ワークフローを提示します。具体的には、データの取得とソフトウェアのセットアップから始まり、Seuratに基づくデータの読み込み、品質管理、正規化、複数サンプルの統合、クラスタリング、および空間可変遺伝子解析までを順に説明します。その後、リファレンスガイドに基づくSPOTlight解析や、教師なしのSTdeconvolveトピックモデリングを含む相補的なデコンボリューション戦略を適用し、続いてGiottoを用いた空間的な細胞間相互作用解析と、カスタムPython Dashアプリケーションを使用したインタラクティブな関心領域（ROI）の選択を行います。スクリプトベースの実行、明示的なパラメータの根拠、期待される出力、およびトラブルシューティングのチェックポイントを重視することで、本プロトコルは、データセットおよびプラットフォーム固有のパラメータ評価を経た後、標準的なアレイベースのSTデータセットおよび関連プラットフォームに適応可能なフレームワークを提供します。

概要

空間トランスクリプトミクス（ST）は、組織切片内におけるメッセンジャーRNA（mRNA）分子の空間座標を保持したまま、ゲノムワイドな遺伝子発現を測定する革新的な技術群である。ST法には、位置バーコード化アレイを用いるシーケンシングベースのアプローチと、完全な組織微小環境内で転写シグナルをマッピングするin situイメージングアプローチが含まれる^1,2。空間的なコンテキストを保持することで、STは組織構造、細胞近傍の組織化、細胞間コミュニケーション、および組織解離後では十分に解明できない微小環境に関連する生物学的プロセスの解析を可能にする³。

公開STデータリポジトリの急速な拡大により、二次解析や手法開発においてかつてない機会がもたらされています³。CROSTデータベースなどのリソースは、複数の種や技術プラットフォームにわたる数百の空間分解能トランスクリプトームデータセットをキュレートしており、一方でSTOmicsDBのような特化型のコレクションは、Stereo-seqなどの特定の解析手法に焦点を当てています^4,5。このようなデータの豊富さがあるにもかかわらず、空間データ構造の複雑さ、解析ツールの多様性、および再現可能なワークフローを実装する上での技術的ハードルにより、計算解析は依然として困難な課題となっています^{6,7,8,9,10,11}。

単一のソフトウェア環境に依存することによる制限を解消するため、相補的な解析ツールを活用した統合的な計算ワークフローを本稿で提示します。既存の包括的なST解析エコシステムには、主にSeurat、Giotto、およびSquidpy^6,7,12などのPythonベースのフレームワークが含まれます。SquidpyのようなPythonベースのツールは空間グラフ解析において広範な機能を提供していますが、主要な計算パイプラインを単一のプログラミング言語環境に集約することで、言語間での技術的な障壁を最小限に抑えることができます。したがって、言語間の技術的障壁を軽減するため、コアパイプラインは主にRで実装されています。このRベースのワークフローにおいて、シングルセルおよび空間トランスクリプトームのワークフローで一般的に使用されているSeuratを、データの読み込み、品質管理、正規化、次元削減、可視化、およびマルチサンプルの統合に使用します。その後、Giottoを用いて空間ネットワークの構築およびリガンド・受容体に基づく細胞間通信解析を行います。このように、本パイプラインはSeuratによる前処理および統合とGiottoによる空間解析を連携させ、2つのツールセット間のデータ転送を明示的かつ再現可能な形式で維持しています。

このフレームワークでは、2つの相補的なデコンボリューション戦略が実装されています。1つはscRNA-seqデータを使用して細胞型の比率を推定するリファレンスガイド法であるSPOTlightであり、もう1つは潜在的な転写パターンを特定する非教師ありトピックモデリング法であるSTdeconvolveです^8,11。これらの出力は空間的な細胞不均一性の相補的な視点を提供しますが、ユーザーがプロトコルに記載されている任意の整合性解析を行わない限り、定量的なクロスバリデーションとしては扱われません。また、インタラクティブな関心領域（ROI）アノテーション用のカスタムPython DashアプリケーションであるSelect Spatial Spotsが統合されており、以降のダウンストリーム解析に使用可能な標準的な座標ベースのアノテーションファイルをエクスポートします。

実用性に関しては、本ワークフローは主に標準的なアレイベースのSTデータ（例：解像度 55 µm のVisium）を対象としており、パラメータの評価後に他の組織型へ適応させることが可能です。解析前に、主要な制限事項を考慮する必要があります。第一に、参照ガイド付きデコンボリューションモジュールは、高品質で組織が一致したscRNA-seqリファレンスに依存します。第二に、サブセルラーまたはシングルセルに近いプラットフォームでは、統合前に前処理の変更、空間的なビンの集約、または画像ベースの細胞セグメンテーションが必要になる場合があります²。代表的なマウス結腸データセットは、本ワークフローが空間ドメインおよびマーカーで定義された組織構成をどのように評価できるかを示すデモンストレーションとして使用されており、あらゆるプラットフォームへの汎用的な互換性を証明するものではありません。

プロトコル

本プロトコルで解析されるすべての生物学的データセットは公開されており、厳格にデモンストレーション目的で使用されています。特定のデータアクセッション番号およびソースリポジトリは、関連する手順の中で提供されます。元のデータセットは、各ソース研究に適用される機関の倫理ガイドラインに従い、元の研究者によって作成されました。必要なすべてのソフトウェアおよびRパッケージのバージョンを確認するには、材料表を参照してください。

ハードウェア要件：このワークフローに必要な計算メモリは、解析するサンプル数およびスポット数に応じて変動します。一般的な空間トランスクリプトームデータセット（例：最大3サンプルで、1サンプルあたり約3,000スポット）の場合、パイプラインの実行には最低16 GBのRAMを搭載した標準的なワークステーションで十分です。ただし、SCTransform正規化やデコンボリューション中の行列分解など、メモリ負荷の高い計算ステップにおいて最適なパフォーマンスと安定性を確保するためには、32 GB以上のRAMを搭載することを強く推奨します。

1. データの取得とディレクトリ構造の準備

1. 公開されている空間トランスクリプトームデータセット（例：GEOアクセッション GSE169749、投稿日 2021年3月26日、最終更新日 2022年3月6日）およびシングルセルRNA-seqリファレンスデータ（例：GEOアクセッション GSE264408、投稿日 2024年4月19日、最終更新日 2024年12月10日）を入手する。
2. リポジトリから生データアーカイブ（例：GSE169749_RAW.tar）をダウンロードし、アーカイブを解凍する。
   注：本プロトコルで使用している代表的なデータセットでは、解凍後のディレクトリにサンプルごとの複数のファイルが含まれており、ファイル名には通常GEOサンプルのアクセッション番号（例：GSM5213483）が組み込まれている。
3. Seuratの Load10X_Spatial 関数と互換性のある標準的なディレクトリ構造にファイルを整理する。
   1. メインのデータディレクトリ（例：./data/）を作成する。
   2. サンプルごとに専用のサブディレクトリ（例：./data/sample_A1/）を作成する。
   3. 各サンプルの以下の必須ファイルを、それぞれのサブディレクトリに転送（コピーまたは移動）する。
      1. filtered_feature_bc_matrix.h5 ファイルをサンプルのメインサブディレクトリに配置する。
      2. 各サンプルディレクトリ内に spatial/ サブフォルダを作成する。
      3. 以下のファイルを spatial/ サブフォルダに配置する： tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz, および tissue_hires_image.png.gz.
   4. spatial/ フォルダ内の .gz ファイルを解凍する。元のファイル名が Load10X_Spatial 関数で要求される形式（例：tissue_positions_list.csv）と完全に一致していることを確認する。
      注：スムーズな読み込みを実現するための最終的な整理構造は、サンプルA1を例として以下のパターンに従う必要がある：
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. ソフトウェア環境のセットアップ

1. R（バージョン 4.4.3 以降）をインストールします。
2. GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow、再現性のためにコミットハッシュ 2d85e18 を使用）から解析スクリプト（1_ReadSpatialData.R から 8_Giotto_Communication.R）を取得します。
3. スクリプト setup.R を実行して、CRAN および Bioconductor から必要な R パッケージをインストールします。
   注：本ワークフローで使用される特定のパッケージバージョンの包括的なリストは、Table of Materials に記載されており、関連する GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow）内の session_info.txt ファイルでも確認可能です。
4. 公式ドキュメントに記載されているインストールコマンドを実行して、Giotto Suite をインストールします。
   1. 公式インストールURL（https://giottosuite.com/articles/installation.html）にアクセスし、セットアップスクリプトを取得します。
   2. ステップバイステップの指示に従い、必要な Python 環境およびシステム依存関係を初期化します。
5. 視覚化を強化するための追加パッケージをインストールします。
   1. install.packages(c("ggprism", "colorBlindness")) を実行します。
6. カスタムツール Select Spatial Spots をインストールします。オペレーティングシステムが Windows、macOS、または Linux であり、Python バージョン 3.8 以降がインストールされていることを確認してください。このステップは任意です。
   1. GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots、再現性のためにコミットハッシュ d20946e を使用）にアクセスし、ソースコードをダウンロードしてツールを取得します。
   2. ツールのディレクトリに移動し、Python の依存関係をインストールします： pip install -r requirements.txt
7. SCTransform 正規化を高速化するため、BiocManager::install("glmGamPoi") を実行して glmGamPoi パッケージをインストールします。
   注：コアワークフローには、ステップ 2.1～2.3 および 2.6 に記載されているパッケージのみが必要です。Rfast2 パッケージは、モランの I 統計量の計算を高速化するために使用されます。ステップ 2.5 の任意パッケージは、Prism スタイルのテーマ（ggprism）を用いた論文投稿用プロットの作成および、色覚多様性に配慮したパレット（colorBlindness）へのアクセスのためのものです。ステップ 2.6 のツールは、インタラクティブなスポット選択機能を可能にします。sessionInfo() コマンドを実行し、コンソールの全出力をテキストファイルに保存してください。これにより、長期的な再現性を確保するために不可欠な、正確なソフトウェアバージョンとパッケージの依存関係が記録されます。

3. 空間データの読み込みと品質管理(1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. 空間データをSeuratオブジェクトに読み込みます。
   1. 使用法 Read10X_Image 高解像度の組織画像を手動で読み込み、以下を指定します。 image.dirおよびimage.name。
   2. 使用法 10X_Spatialのロード 〜を用いて 画像 ステップ3.1.1で作成した画像オブジェクトにパラメータを設定し、Seuratオブジェクトを作成します。
2. 品質管理指標を算出する。
   1. 以下の方法を用いて、ミトコンドリアリードの割合を算出します。 パーセンテージ特徴量セット パターンを用いて ^mt-.
3. QC指標に基づいたデータの可視化および解析を行う。
   1. のバイオリンプロットを作成する nCount_Spatial, nFeature_Spatial、および ミトコンドリア遺伝子割合 使用して バイオリンプロット.
   2. 以下を使用して、これらの指標の空間的特徴プロットを作成します。 SpatialFeaturePlot 組織領域外のスポットを特定するため。
      注：視覚的チェックポイント：組織領域外のスポットは、通常、低いUMIカウントを示します（nCount_Spatial < 500) および低遺伝子検出（nFeature_Spatial < 200)
   3. デモンストレーションのため、低品質のスポットを除去するフィルターを適用します（例： subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial) > 200 & nCount_Spatial > 500)）。これは任意の手順です。
      注：空間トランスクリプトーム解析における品質管理（QC）の主な目的は、組織外のスポットなどの技術的なアーティファクトを特定し、注釈を付けることです。デモンストレーション用のVisium結腸データでは、nFeature_Spatial > 200 および nCount_Spatial > 500個の低複雑度または背景ノイズのスポットを除去します。RNA含有量が少ない組織や分解が進んだ切片については、閾値を上げる前にバイオリンプロットと空間的特徴プロットを確認してください。一方、密度が高い組織やUMI数が多い組織では、より厳格な閾値が適切である場合があります。ダブレット、組織の折り畳み、または明らかなアーティファクトが確認できない限り、高発現値のみに基づいてフィルタリングを行うことは避けてください。フィルタリングによって空間的な位置情報が物理的に削除されるため、後続の空間解析において組織構造の連続性が損なわれる恐れがあり、一般的に推奨されません。

4. データの前処理、統合、およびクラスタリング (3_IntegrationAndClustering.R)

1. 個々のサンプルを正規化し、前処理します。
   1. assay = を指定し、各サンプルに個別にSCTransform正規化を適用します。 空間的.
2. 複数のサンプルを統合します。
   1. 統合に向けて、SCT正規化済みのオブジェクトのリストを準備します。各オブジェクトに以下の項目が含まれていることを確認してください。 "RNA" ～をコピーすることによるアッセイ "空間的" アッセイ： spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["空間的"]]
      ​注：～をコピーする "空間的" アッセイを標準化する "RNA" assayスロットは、もともと単一細胞のSeuratオブジェクト向けに設計されたダウンストリームの統合機能との互換性を確保するために必要な回避策として機能します。
   2. 使用方法 統合機能の選択 および PrepSCTIntegration 共通の可変的特徴を特定するため。
   3. 以下を用いてインテグレーションアンカーを特定する FindIntegrationAnchors 〜を用いて 正規化法 = "単一細胞転写解析（SCT）".
   4. IntegrateDataを用いてデータを統合します。 正規化手法 = "単一細胞トランスクリプトーム解析".
3. 統合アッセイに対して、次元削減およびクラスタリングを行う。
   1. 統合データを用いて、以下の手法で主成分分析（PCA）を実行する PCAの実行.
   2. 累積寄与率を算出することで、下流解析に最適な主成分数（PC数）を決定します。累積寄与率が90%を超え、かつ限界利得が0.1%を下回る点など、プログラムを用いてエルボー点を特定します。その際は、以下のコードを使用してください。 3_統合およびクラスタリング.R、36-38行目得られた主成分（PC）の数は、以下のように定義される。 pc.use.
   3. 以下の条件でRunUMAPを実行します。 dims = 1:pc.use.
   4. 以下を用いて細胞をクラスター化します。 近接ノードの検索 〜を用いて dims = 1:pc.use およびFindClustersを用いて 解像度 = 0.5クラスターの安定性とマーカー遺伝子の整合性を確認した後にのみ、解像度を調整してください。
   5. 標的グループ間（例： "B1_結腸_d14" 対比 "A1_結腸_d0"）を用いて マーカーの同定 機能
      ​注：視覚的チェックポイント：統合が成功していれば、UMAPプロットにおいて、生物学的に異なるクラスターを維持しつつ、サンプルが適切に混ざり合って表示されます。
4. 空間的に変動する遺伝子を特定する。
   1. 各元のサンプルについて、以下の操作を行う。 空間的に変動する特徴の抽出（FindSpatiallyVariableFeatures） 〜を使用して "モランズI（Moran's I）" ～における手法 "単一細胞転写解析（SCT）" 空間的自己相関を算出するためのアッセイ。

5. 単一細胞リファレンスデータのプリプロセッシング (4_scDataPreProcessing.R)

1. Read10Xを使用してシングルセルRNA-seqのカウント行列を読み込み、Seuratオブジェクトを作成します。
2. 標準的なQC、正規化、およびクラスタリングを実施します。
   1. ミトコンドリアリードの割合（percent.mt）を算出し、細胞をフィルタリングします（例：nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25）。
   2. vars.to.regress = "percent.mt"に設定し、SCTransformを用いてデータを正規化します。
   3. PCAおよびUMAPを実行し、ステップ4.3.2で説明されている動的PC選択法を用いて細胞をクラスタリングします。
3. 細胞型のアノテーションを行います。
   1. AddModuleScoreを用いて、標準的な細胞型マーカー遺伝子のモジュールスコアを算出します。
   2. モジュールスコアと既知の生物学的知見に基づき、クラスターのアノテーションを行います。あるいは、メタデータから計算済みのアノテーションをインポートします。

6. SPOTlightを用いたリファレンスガイド下でのデコンボリューション (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. SPOTlight用データの準備。
   1. アノテーション済み単一細胞Seuratオブジェクトと空間SeuratオブジェクトをSingleCellExperimentオブジェクトに変換する。
   2. logNormCountsを用いて単一細胞データを対数正規化する。
2. SPOTlightデコンボリューションの実行。
   1. modelGeneVarおよびgetTopHVGsを用いて、単一細胞データの高変動遺伝子（HVGs）を同定する。
   2. scoreMarkersを用いて細胞型マーカー遺伝子を算出し、高品質なマーカー（例：mean.AUC > 0.8）でフィルタリングする。
   3. 計算時間を短縮するため、各細胞型の単一細胞リファレンスを管理可能な数（例：50細胞）までダウンサンプリングする。
   4. weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", gene_id = "gene"を指定して、SPOTlight関数でデコンボリューションを実行する。
3. 結果の可視化とエクスポート。
   1. デコンボリューション結果マトリックス（スポットごとの細胞型割合）を抽出する。
   2. plotSpatialScatterpieを用いて、空間座標上の細胞組成を可視化する。
   3. AddMetaDataを用いて、デコンボリューション結果を空間Seuratオブジェクトのメタデータに追加する。期待される出力：各空間スポットの細胞型割合カラムを持つデコンボリューションマトリックス、局所的な細胞組成を示す空間スキャッターパイプロット、およびメタデータとしてデコンボリューション割合を含むSeuratオブジェクト。

7. STdeconvolveを用いたリファレンスフリーのデコンボリューション(7_STdeconvolve.R)

1. 空間データの準備を行う。
   1. GetAssayData with slot = "counts"を使用して、空間Seuratオブジェクトから生カウント行列を抽出する。
   2. STdeconvolveのcleanCountsを用いて、低品質のスポットおよび遺伝子を除去する（例：min.lib.size = 100）。
2. 潜在的な細胞タイプを特定する。
   1. restrictCorpus を用いて、最小限のスポット割合で発現している遺伝子でコーパスをさらにフィルタリングする（例：removeAbove=1.0、removeBelow = 0.05）。
   2. fitLDAを用いて、潜在的なトピック数（K）の範囲（例：Ks = seq(2, 9, by = 1)）にわたって潜在的ディリクレ配分法（LDA）モデルを適合させる。
   3. optimalModel with opt = "min"を使用し、最小パープレキシティに基づいて最適なモデルを選択する。
3. 結果の解析と視覚化を行う。
   1. getBetaThetaを使用して、最適モデルから細胞タイプ（トピック）の割合（theta）および遺伝子プロファイル（beta）を抽出する。
   2. デコンボリューションされたトピックの生物学的解釈を助けるために、「Select Spatial Spots」ツール（ステップ9.3.3参照）で生成した関心領域（ROI）のアノテーションをインポートする。これらのアノテーションを vizAllTopics関数のgroupsパラメータとして使用し、デコンボリューションされた細胞タイプの割合を空間座標に再投影し、スポットをROIごとに色分けする。これはオプションのステップである。
      注：期待される出力：STdeconvolveは、スポットごとのトピック割合を表すtheta値と、各トピックの遺伝子プロファイルを表すbeta値を返すべきである。教師なしのSTdeconvolveの結果を、リファレンスガイド付きのSPOTlightの出力（ステップ6）と定量的に比較したい場合は、両方の割合行列（STdeconvolveのthetaとSPOTlightの行列）をエクスポートし、標準的なR関数を用いてスポットごとの相関または一致度指標（例：ピアソン相関またはスピアマン相関）を算出できる。SPOTlightとSTdeconvolveの定量的な比較はオプションであり、コアワークフローの実行に必須ではないが、そのような解析を行いたいユーザーのために、関連する出力行列がステップ6.3.1および7.3.1から利用可能である。

8. Giottoを用いた空間的な細胞間相互作用の解析(8_Giotto_Communication.R)

1. SeuratオブジェクトをGiottoオブジェクトに変換します。
   1. createGiottoObject関数を使用し、生カウントマトリックスと空間座標を提供します。
2. Giottoオブジェクトを前処理し、デコンボリューションの結果を追加します。
   1. normalizeGiottoを用いてデータを正規化します。
   2. addCellMetadataを使用して、細胞タイプのアノテーション（例：SPOTlightデコンボリューションによる主要細胞タイプ）を細胞メタデータに追加します.
3. 空間情報を考慮した細胞間コミュニケーションを推定します。
   1. createSpatialNetwork を用い、method = "Delaunay" およびname = "Delaunay_network"を指定して空間ネットワークを作成します。
   2. リガンド・受容体データベースをR環境にロードします。ロードされたオブジェクトが、リガンドと受容体の遺伝子シンボルを表す2つの異なる列を持つデータフレーム形式であることを確認してください（例：Zenodoから提供されているコンパイル済みのマウスネットワーク：https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, version v6, 2025年4月7日公開）。
   3. cluster_column = "celltype_major"を指定してexprCellCellcomを実行し、空間的に近接している細胞タイプ間の有意なリガンド・受容体相互作用を特定します。期待される出力は、リガンド・受容体ペア、ソースおよびターゲットの細胞タイプ組み合わせ、log2 fold-change値、および調整済みP値を含む結果テーブルです。視覚化のために、有意な相互作用（例：p.adj < 0.05）を保持します。

9. select spatial spotsを用いたインタラクティブなスポット選択 (6_SelectSpatialSpots.R)

1. インタラクティブツールのためのデータを準備します。
   1. GetTissueCoordinatesを使用して、Seuratオブジェクトから空間座標を抽出します。
2. データをフォーマットしてエクスポートします。
   1. 座標データフレームの列ヘッダーが、正確にCELL_ID, X, Yとなるようにフォーマットします。
   2. フォーマットしたデータフレームをCSVファイルにエクスポートします。
3. 関心領域（ROI）解析を行います。
   1. カスタムのSelect Spatial Spots Dashアプリケーションを起動し、CSVファイルをロードします。
   2. 空間的な位置に基づいて、スポットをインタラクティブに選択します。
   3. 選択したスポットのリストと、割り当てられたグループ/ROIラベルを新しいCSVファイルとしてエクスポートします。期待される出力：スポット識別子、X/Y座標、および割り当てられたグループ/ROIラベルを含むCSVファイルで、これはCELL_IDによってSeuratオブジェクトと照合可能です。

結果

ワークフローの実施とデータの統合により、組織の主要な特徴が示されます

解析ステージ全体における期待される出力を示すため、この計算ワークフローをマウス結腸の空間トランスクリプトームデータに適用した。ワークフローの概略図（図1）に示すように、パイプラインはデータの取得と品質管理から始まり、空間的特徴プロットによって組織の境界を定義した（図2A,B）。次に、解釈可能な生物学的変動を維持しつつ、技術的なバッチ効果を低減させるために、Seuratのアンカーベースの統合ワークフローを用いた。UMAPによる可視化では、統合後のサンプルのアライメントと空間的なクラスターパターンが示された（図2C,D）。次元削減および後続のクラスター解析の指針とするため、累積分散に基づいた主成分（PC）の定量的かつ動的な選択を実装した（補足図1参照）。マーカー遺伝子のヒートマップ解析により、空間的クラスターの根底にある明確な転写プロファイルが示された（図2E）。

計算上のクラスターが結腸組織学の既知の解剖学的構造と一致しているかを確認するため、標準的な層特異的マーカー遺伝子の発現プロファイルを評価した。粘膜上皮層では、EpcamおよびKrt8を含む上皮細胞マーカーと、杯細胞マーカーであるMuc2の発現が認められた。Col1a1やVimなどの間葉系およびストローマーカーは、固有層および粘膜下層領域を標識し、一方で外側の固有筋層はActa2やTaglnなどの平滑筋構造遺伝子によって示された。これらの系譜関連マーカーの空間的な制限は、統合およびクラスター化のワークフローが、粘膜から筋層にかけての軸に沿った結腸組織の主要な組織学的層構造を保持していたという解釈を支持している（Supplementary Figure 2を参照）。

クラスターの検証後、実験条件間での変動発現遺伝子（DEG）を特定するために、ダウンストリームの差異発現解析を実施した（Figure 2F,G）。さらに、Moran's I 統計量を用いて空間変動遺伝子を特定し、組織全体で有意な非ランダムの空間分布を示す遺伝子を明らかにした（Figure 2H）。

細胞デコンボリューションと空間相互作用ネットワークによる組織微細構造の解明

シングルセルRNA-seqリファレンスデータの処理により、QCフィルタリング（図3A）、非教師ありクラスタリング（図3B）、マーカー遺伝子の検証（図3C）、および独立したアノテーションとの一致（図3D）によって裏付けられたアノテーションが得られた。細胞組成（図3E）に基づき、デコンボリューションのためのダウンサンプリング戦略を決定した。SPOTlightを用いて、空間スポットにおけるリファレンスガイドによる細胞型比率を推定し（図4A,B）、一方でSTdeconvolveを用いて、空間的な細胞パターンの非教師ありトピックモデリングによる視覚化を行った（図5B）。カスタムのSelect Spatial Spotsツールを用いて、これらのパターンの組織学的コンテキストを確認した（図5A）。最後に、デコンボリューションされた細胞型割り当てを用いて空間通信解析を行い、空間的に近接する細胞型グループ間のリガンド-受容体相互作用を特定した（図6A,B）。

プロトコルの最適化から得られたトラブルシューティングの知見

プロトコルの最適化において、実用的なチェックポイントの指標となるいくつかの課題が特定されました。シングルセルのリファレンスが組織のコンテキストと十分に一致していない場合、デコンボリューションの結果が最適にならないことがあり、利用可能な場合は組織および種が一致したscRNA-seqデータを使用する必要があることが示されました。デフォルトのパラメータを用いた初期のクラスタリングでは、期待される生物学的構造が必ずしも分解できないことがありましたが、PCの選択、クラスタリング解像度、およびマーカー遺伝子のコヒーレンスを検討することで、組織解剖学に沿った空間的に解釈可能なドメインを特定することができました。これらの観察結果は、ワークフローの実行中にユーザーが一般的な解析上の問題を診断する方法についての実際的な例となります。

図1統合的空間トランスクリプトーム解析のワークフロー。 データ取得および前処理から高度な空間解析に至るまでの、解析パイプラインの概略図。主要なステップは以下の通りである：(1) Seuratを用いたデータの読み込み、品質管理、および複数サンプルの統合、(2) 空間クラスタリングおよび空間可変遺伝子の検出、(3) 細胞型のデコンボリューション 経由で リファレンスベース（SPOTlight）および教師なし（STdeconvolve）の手法；(4) Giottoを用いた空間的な細胞間コミュニケーション解析、およびカスタムツールを用いたインタラクティブな関心領域（ROI）の選択 空間的スポットの選択すべてのモジュールの結果を統合し、組織構造および細胞微小環境に関する生物学的知見を導き出します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2データの統合、クラスタリング、および変動発現解析。 (A、B) 空間試料A1およびB1の品質管理指標。遺伝子数、UMI数、およびミトコンドリア遺伝子割合の分布を示す。 (C) 統合された空間トランスクリプトームデータのUMAP可視化。サンプル由来別（左）およびクラスター同一性別（右）に色分けしている。 (D) 組織切片へのクラスター同一性の空間的投影。 (E) 各空間的クラスターにおける上位マーカー遺伝子のヒートマップ。 (F) 条件A1_colon_d0とB1_colon_d14の間で差分発現した遺伝子を示すボルケーノプロット。 (G) 組織切片における代表的な発現変動遺伝子の空間的発現パターン（H特定された上位の空間変動遺伝子の空間発現マップ 〜を介して モランのI統計量。左側の2つのパネルはサンプルA1_colon_d0の遺伝子を、右側の2つのパネルはサンプルB1_colon_d14の遺伝子を表示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 単一細胞リファレンスデータの処理とアノテーション。 (A) フィルタリング前後におけるscRNA-seqリファレンスデータの品質管理指標。 (B) 非教師ありクラスタリングに基づいて色分けされたscRNA-seqデータのUMAP可視化。 (C) 各クラスタにおける標準的な細胞型マーカー遺伝子の発現スコアを示すドットプロット。 (D) 主要な細胞型がラベル付けされた、アノテーション済みscRNA-seqデータのUMAP可視化。 (E) scRNA-seqリファレンスデータセットの細胞組成。赤い破線は、計算効率と細胞型の代表性のバランスを調整するためにSPOTlightデコンボリューション中に適用されたダウンサンプリング閾値（n = 50 cells per type）を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 細胞不均一性の空間的デコンボリューション。(A,B) SPOTlightデコンボリューションによる空間的スキャッターパイプロット。サンプルA1 (A)およびB1 (B)の各スポットにおける主要な細胞型の構成比率を示す。 (C) サンプルA1 (左)およびB1 (右)におけるB細胞の代表的な空間分布。デコンボリューションを通じて同定された特定の免疫細胞集団の、空間的に分解された局在パターンを示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 5: インタラクティブな関心領域（ROI）解析と教師なしデコンボリューションの比較。(A>) カスタムツール「Select Spatial Spots」のインターフェース。近位結腸、遠位結腸、およびその他の組織領域に対応する領域をインタラクティブに選択している様子を示すところである。(B>) サンプル A1における教師なしデコンボリューション（STdeconvolve）の結果を空間散布パイ図で可視化したもの。スポットは(A>)で手動アノテーションした領域に基づいて色分けされており、組織学的なアノテーションと計算によって得られた細胞トピック分布との対応関係を示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図6: 空間情報を考慮した細胞間相互作用ネットワーク。(A,B>) サンプルA1 (A) および B1 (B) について、Giottoにより推定されたリガンド-受容体相互作用ネットワーク。ノードは細胞型を表し、エッジは有意なリガンド-受容体ペア (FDR < 0.05) を表し、エッジの太さは相互作用の強さに対応している。比較可能性と視覚的な明瞭さを確保するため、すべてのサンプルに一一律の有意性しきい値 (FDR < 0.05) を適用し、各条件についてlog2FCでランク付けされた上位20件の相互作用を表示している。ネットワークは、結腸組織の空間的コンテキストにおける細胞型特異的な通信パターンを強調している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

付随図1：次元削減におけるパラメータ最適化の定量的評価。エルボープロットは、主成分（PC）の最適な数を動的に選択するためのワークフローのプログラム的なアプローチを示している。この選択は、累積標準偏差とマージナル分散の閾値（赤色の垂直線で表示）に基づいて算出されており、ダウンストリームのクラスタリング前に、テクニカルノイズを軽減しつつ生物学的分散を捉えることを目的としている。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図2：大腸の層特異的な標準マーカーを用いた空間的なクラスター化の検証。(A) 計算上のクラスターにおける上皮、間質、および平滑筋マーカーの濃縮発現を示すドットプロット。(B) 代表的なマーカー（Epcam、Col1a1、Acta2）を組織座標にマッピングした空間的特徴プロット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本プロトコルでは、解析の深度と実用的なアクセシビリティを両立させた、空間トランスクリプトームデータ解析のための包括的な計算ワークフローを提供します。ステップバイステップのアプローチにより、初期のデータ取得から高度な空間解析に至るまでの完全な解析パイプラインを研究者に提示し、同時に重要な意思決定ポイントや潜在的な落とし穴についても強調して解説します。

本プロトコルのいくつかのステップは、後続の結果に大きな影響を与えるため、特に注意が必要です。品質管理およびフィルタリングのしきい値は、特定の組織型やテクノロジープラットフォームに合わせて慎重に調整する必要があります。フィルタリングが厳しすぎると生物学的に重要なスポットが除去される可能性があり、逆にしきい値が緩すぎるとテクニカルノイズが混入する可能性があるためです。また、正規化手法の選択は、その後のクラスタリングおよび差異発現解析の結果に大きく影響します。例えば、本パイプラインでは標準的な対数正規化（log-normalization）ではなくSCTransformを使用しています。これは、SCTransformがシングルセルおよび空間解析ワークフローにおいて、シーケンス深度などのテクニカルエフェクトに関連する技術的変動をモデル化し、低減させることが報告されているためです^14,15。統合（integration）の際、統合機能（integration features）と解像度パラメータの選択については、統合の強度と生物学的シグナルの保存のバランスを維持するために慎重な検討が必要です。空間的に変動する遺伝子の同定（spatially variable gene calling）については、計算上のスケーラビリティと、アレイベースのデータにおける空間的自己相関分析への適合性からMoran's Iを選択しましたが、データセットのサイズや研究目的に応じて、SPARKなどの代替手法を検討することも可能です¹⁶。

このワークフローのトラブルシューティング項目では、あるパッケージから次のパッケージへ出力を渡す際に発生する一般的な相互運用性の問題に焦点を当てています。単一の汎用的な変換ステップに頼るのではなく、本ワークフローでは各ソフトウェアインターフェースにおいて最適化されたフォーマット変換を行います。具体的には、Seuratでの統合前に空間カウントデータを標準的なRNAアッセイスロットにコピーし、SeuratおよびシングルセルリファレンスオブジェクトをSPOTlight用のSingleCellExperimentオブジェクトに変換し、空間カウント行列をSTdeconvolve用に再フォーマットします。また、細胞間コミュニケーション解析のために、Seurat由来のカウント、座標、および細胞型メタデータをGiottoオブジェクトに変換し、Select Spatial SpotsによるROIアノテーションを、Seuratオブジェクトに再マッピングできるようCELL_ID、X/Y座標、およびグループラベルを含むCSVファイルとして書き出します。これらのステップにより、ユーザーは、互換性のないアッセイスロット、不一致のスポット識別子、不足しているメタデータ列、不正確な座標フォーマット、およびリガンド・レセプターの遺伝子シンボルの不一致といった一般的な問題を特定し、修正することが可能になります。

このワークフローのさらなる特徴は、単一のアルゴリズムに依存せず、2つの相補的なデコンボリューション戦略を利用している点にあります。SPOTlightは、細胞型の割合をリファレンスに基づいて推定するために既知のscRNA-seqリファレンスを使用しますが、一方でSTdeconvolveは、リファレンスを用いない潜在的な転写トピックの抽出を可能にします。デモンストレーションデータセットにおいて、STdeconvolveのトピックは組織学的に定義された領域と一致し（図5B）、生物学的な解釈可能性が裏付けられました。本プロトコルでは、これら2つの手法の直接的な定量比較は行っていません。自身のデータでベンチマークを行いたいユーザーは、プロトコルのステップ7.3.2に記載されたフレームワークに従ってください。さらに、本プロトコルでは、コア機能にスクリプトを使用することでユーザビリティとトレーサビリティを確保しつつ、直感的なROIの切り出しを可能にするグラフィカルインターフェース（Select Spatial Spots）を提供しています。

SeuratとGiottoを連携させることで、Seuratベースの前処理および統合と、Giottoベースの空間統計およびネットワーク解析を組み合わせたワークフローが可能になります。SeuratはscRNA-seqの経験を持つ研究者にとって確立された環境を提供し、マルチサンプルの統合をサポートします。一方、調和させたデータをGiottoに転送することで、空間ネットワークの構築やリガンド-受容体解析が可能になります。この設計により、ユーザーは両プラットフォームの実証済みの強みを活用できますが、本プロトコルにおいてSquidpyや他のフレームワークとのベンチマーク評価を行ったことを意味するものではありません。細胞間コミュニケーションに関しては、Giottoのドロネーネットワーク（Delaunay network）に基づくリガンド-受容体推論を使用しました。これは、同一の解析環境内で空間的な隣接性を組み込めるためです。CellChatなどのフレームワークは広範なシグナリングデータベースを提供していますが、本プロトコルでは評価していません¹⁷。

いくつかの制限を考慮する必要があります。リファレンスベースのデコンボリューションアプローチは、高品質で一致したシングルセルリファレンスの利用可能性に決定的に依存します。さらに、細胞間相互作用解析の根底にある基本的仮定は、転写物の共発現を物理的なタンパク質相互作用の代用としているため、その後の実験的検証が必要です。最後に、このワークフローは主に標準的なVisiumデータセットを中心に開発されました。Visium HDのようなニアシングルセル解像度の技術に向けて分野が進展するにつれ、解析上の考慮事項は変化します。より高解像度のデータでは、異なる前処理パラメータが必要となる可能性があり、スポットデコンボリューションの絶対的な必要性が低下する可能性があります。このワークフローをVisium HDデータセットに適応させるには、高解像度のビンを計算的に統合してより大きな空間ビンにするか、あるいはスポットデコンボリューションモジュールをバイパスして画像ベースの細胞セグメンテーションを採用することができます¹⁸。

これらの機能は、発生生物学、神経科学、がん研究、免疫学など、さまざまな生物学的領域への適用可能性を示唆しています^19,20,21,22。モジュール設計により、研究者は空間ドメインの同定、細胞間通信、または領域的な特殊化など、自身のニーズに合わせて特定のコンポーネントを適応させることが可能です。空間技術が進化し、データセットが拡大し続ける中で、本プロトコルは、新しい分析手法を取り入れ、新たな生物学的疑問に対処するための基盤を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	高度なデータ可視化
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	空間ネットワークおよび細胞間コミュニケーション解析
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	プロットの合成および配置
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	コア実行環境 (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	シングルセル品質管理および可視化
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	シングルセル分散モデリングおよびマーカー検出
Select Spatial Spots (カスタムPythonツール)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	インタラクティブな空間関心領域 (ROI) 選択 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	空間データの前処理、統合、およびクラスタリング
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	シングルセルおよび空間データ用データ構造
SingleCellExperiment	Bioconductor Core Team	v1.28.1 (Bioconductor)	scRNA-seq用標準データコンテナ
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	リファレンスガイド付き空間デコンボリューション
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	教師なし潜在トピックモデリング
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	コアデータ操作およびフォーマットスイート