研究記事

フローサイトメトリーにおける異なるゲート戦略を用いた精子DNA解析結果の比較

DOI：

10.3791/70417

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2026年7月10日

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1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

この記事について

サマリー

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多角形ゲート(PGG)および十字形ゲート(CFG)は、精子DNAの完全性を検出するためのフローサイトメトリー手法です。PGGはDNA断片化指数(DFI)および高いDNA染色指数(HDS)を測定します。CFGは重度のDFI、軽度のDFI、そして全体的なDFIを報告しています。本研究は、それらの結果と相関を比較することを目的としています。

要約

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精子DNAの完全性は、受精、胚の発生、そして継続的な妊娠を保証する重要な要素です。DNA変性後のフローサイトメトリーとアクリジンオレンジ染色による精子クロマチン構造評価(SCSA)は、精子DNA評価のゴールドスタンダードとされています。精子DNA断片化指数(DFI)のフローサイトメトリーに基づく評価のためのゲーティング戦略として、文献では多角形ゲート(PGG)と十字形ゲート(CFG)の2つのゲーティング戦略が報告されています。本研究の目的は、PGGとCFGのアッセイ結果の関係を比較し、基本的な精液分析のパラメータとの相関を解析することでした。両手法で独立して得られたデータは、Bland-Altmanプロットや回帰分析を含む統計解析を用いて比較されました。当病院の生殖センターで生殖能力評価を受ける男性外来患者121名が、完全無作為抽出法で選抜されました。精子DFIおよび関連指標は、それぞれPGGおよびCFGを用いたフローサイトメトリーで検出されました。結果は、両方法から得られたDFI値が良好な一致を示していることを示しました。PGG法のDFIpとCFG法のDFIm、DFIs、DFIcの相関係数はそれぞれ0.6497、0.9404、0.9667でした(いずれ p <0.01)。高いDNA染色指数(HDS)はDFIとわずかに負の相関を示しました(r = -0.3042、 p < 0.05)。進行性の運動精子の割合はDFIp、DFIs、DFIcと負の相関を示しました(r = -0.3824、-0.3794、-0.3574、いずれも p < 0.05)。HDSと精液量、精子濃度、総精子数、またはPR(%)との間に有意な相関は認められませんでした。これらの発見は、DFIが男性の生殖能力とより密接に関連していることを示しており、このパラメータを提供するCFG法が精子DNA損傷の臨床評価により適している可能性を示唆しています。

概要

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精子DNAの完全性とは、精子核内のDNA分子構造の完全性と機能的安定性を指します。具体的には、染色質の構造が正常で、塩基配列が破損や酸化損傷のない完全な配列、そして遺伝情報を子孫に正確に伝達する能力が特徴です。精子生成の過程で、酸化ストレスが増加する1、クロマチンの再構築が異常である2、または環境毒素の影響を受ける場合3、精子DNAの完全性が損なわれ、塩基の不一致、喪失、修飾、DNAの付加や架橋、単一鎖および二本鎖の断線などが起こります。さらに、損傷した精子DNAは男性の生殖能力を損ない、補助生殖技術(ART)における妊娠結果に悪影響を及ぼす可能性があります4、また再発性の喪失リスクも高めます5。2021年、欧州泌尿器科学会(EAU)は男性の生殖能力評価システムにDFI検査を含めることを推奨しました。

現在、精子DNAの完全性は主に精子DNA断片化指数(DFI)を検出することで評価されています。フローサイトメトリーによる精子クロマチン構造アッセイ(SCSA)はDFI7を評価する主要な方法です。文献では、精子DFI検出のための2つのフローサイトメトリーゲーティング法が報告されています。1つは多角形ゲート法(PGG)で、精子DFIやHDS8などの2つの重要な指標を同時に報告できます。PGGは、検出変動係数が小さく、再現性が優れているのが特徴の古典的なSCSAアプローチです。しかし、DNA損傷の重症度を区別することはできません。もう一つのタイプは十字形ゲート法(CFG)で、精子DNAの重度損傷マーカー(DFIs)、軽度の精子DNA損傷マーカー(DFIm)、および十字形ゲート法の総DFIを報告できます。DFIcはDFIsとDFImの合計に等しいです。精子DNAの完全性を評価する現在の技術と比較して、CFG法は精子DNA損傷の重症度を反映できます10。

精子の質を評価するのにどちらの方法がより適しているかを判断するため、本研究ではPGG法とCFG法の両方を用いて精子のDFIおよび関連パラメータを測定しました。これら2つの方法の結果と従来の精液分析パラメータとの相関を比較しました。私たちの知る限り、PGGとCFGの2つの手法の検出結果の相関を解析した初の研究です。

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プロトコル

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本研究は南京医科大学付属淮安第一人民病院の医療倫理委員会により承認されました(承認番号:KY-2024-181-01)。本研究で使用されたサンプルの患者からインフォームド・コンセントを取得しました。 図1に示されたワークフローの全体的な回路図。使用された試薬や機器の詳細は 材料表に記載されています。

フローサイトメーター用のCFG設定
酸処理後、損傷DNAを持つ精子の核クロマチンは単鎖DNAを示しますが、損傷のないDNAを持つ精子の核クロマチンはその二本鎖構造を保持します。蛍光染料アクリジンオレンジ(AO)は単鎖DNAに結合し、488nmレーザーで励起されると赤色蛍光を放出します。二本鎖DNAに結合すると、488 nmレーザーで励起されると緑色蛍光を放出します。フローサイトメーターが捕捉した赤緑蛍光信号の数に基づき、赤色蛍光と赤緑色蛍光の合計の比率を計算し、これが精子のDFIを表します。

CFG設定はYangらの概要に従って実装されました。フローサイトメーターは、AO染色された正常精子で測定された最も低い緑色蛍光と最も高い赤色蛍光を境界基準として設定すべきです(図2)。以下はCFG内の各象限の細胞特性の一覧です。
Q1象限は正常な精子を示しています。精子DNAは無傷で、AOの結合量も最小限で、緑色蛍光が見られました。
Q2象限の精子は部分的にDNAが断片化しており、蛍光顕微鏡下ではオレンジ色に見えます。このようなDNAは修復可能であり、これらの精子は軽度のDNA断片化(DFIm)に分類されます10。
Q3象限は、減算を経た非特異的蛍光として定義されます。
Q4象限の精子はDNAが断片化しており、蛍光顕微鏡で赤色に見えるため、重度のDNA断片化(DFI)を示しています。

Q2とQ4の精子は共に断片化されたDNAを含み、その合計はDFIcと定義される。

フローサイトメーター用のPGG設定
フローサイトメトリクス解析のための多角ゲートは、Evensonらが説明した方法に従って確立されました。図3に示すように、各ゲートに関連する細胞特性は以下の通りです。
P3は変性DNAを持つ細胞の割合を示します。
P4は高いDNA染色性(HDS)を持つ精子を表します。この精子群は正常なヒストンからプロタミンへの交換を欠いています。
P3ゲートおよびP4ゲートの外側に位置する主要な細胞集団は正常な精子で構成されており、赤色蛍光が減少し、主に緑色蛍光を放出します。

精液サンプルの採取と分析
121点の精液サンプルはすべて、南京医科大学付属淮安第一病院生殖センターを訪問した男性からのものでした。2〜7日間の禁欲期間を経て、マスターベーションによって精液サンプルを採取しました。通常の精液分析は、 WHOのヒト精液検査・処理に関する検査マニュアル11,12の要件に厳密に従って実施されました。精子濃度および運動性の分析は、コンピュータ支援精子分析システム(CASA)を用いて実施されました。各サンプルは2回分析されました。結果は、両結果の差が95%信頼区間内にある場合にのみ平均として報告されました。それ以外は再サンプリングと分析が行われました。

DFI解析
フローサイトメトリーキットの試薬A中の精子濃度を2–3 x 106/mLにするために必要なサンプル量を計算します。計算方法:元の精液標本中の精子濃度がM × 106/mLと仮定し、必要な精液量(μL)=150/Mを基準にします。計算された精液量をフローサイトメーターチューブに加え、試薬A50 μLを加えて優しく混ぜます。試薬Bを100μL加え、優しく混ぜて室温で30秒培養します。すぐに試薬C300μLを加え、優しく混ぜます。フローサイトメーターのCFGとPGGを用いてサンプルを検出し、少なくとも5000個の精子を分析します。

統計解析
データはGraphPad Prism 6.0を用いて統計解析を行いました。PGGとCFGの一致度を評価するために、平均と差分を計算してBland-Altmanプロットを構築しました。両方法の違いを平均値と比較してプロットしました。さらに、PGGとCFGの相関を解析するためにピアソン法が用いられました。p値が0.05未満であれば統計的に有意であることが判明しました。

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結果

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121名の研究参加者(平均年齢:32.5歳±4.9歳;範囲:26〜44歳)のうち、28名が無精子症、4名が少精子症と診断されました。ベースラインの人口統計的特徴および精液分析パラメータは 表1にまとめられています。

図4に示されているように、Bland-AltmanプロットはPGG法およびCFG法による精子DFI結果が非常に一貫性を示していることを示しました(r = 0.9667、p = 0.0000)。+10%を超える不一致が見られたのは2サンプルのみで、3サンプルは-10%未満で、それぞれ1.7%と2.5%の割合でした。

表2は PGG由来のDFIpとCFG由来の3つのパラメータ(DFIm、DFIs、DFIc)それぞれとの間に強い正の相関を示しています。相関係数はそれぞれ0.6497、0.9404、0.9667で、p値はすべて0....

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ディスカッション

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WHOヒト精液検査・処理実験マニュアル第6版12 では、精子DNAの完全性を評価するために4つの方法を推奨しています:末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(dUTP)ニックエンドラベリング(TUNEL)、単細胞ゲル電気泳動(Comet)アッセイ、SCSA、精子クロマチン分散(SCD)検査です。その中でも、SCSAはフローサイトメトリーを用いた分析により、高スループット、効率、客観性、さらにDFIやHDS7などのパラメータを同時に報告できるため、男性学の研究室で広く採用されています。世界的な調査によると、世界中の生殖医療従事者の約4分の1(24.1%)が精子DNAの完全性を評価する方法としてSCSAを選択しています。

SCSA手順で最も重要なステップは、適切なフローサイトメトリーゲーティングの確立です。従来のPGG法は、DNA鎖の断片(DFI)と異常に高いDNA染色(...

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開示事項

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著者たちは何も明かすことはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コンピュータ支援精子分析システム北京随佳ソフトウェア有限公司SA-II 
フローサイトメーター 深圳明瑞生物医学電子有限公司Cyto E6
フローサイトメトリーキット深圳BREDバイオテクノロジー有限公司
マックラーカウントチャンバーセフィメディカルインスツルメンツ
精子核DNA完全性キット深圳BREDバイオテクノロジー有限公司-

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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