スケーラブルなナノフィトスメティック製剤のための、在来の新熱帯サバンナ植物からマグネシウムナノ粒子をグリーン合成する

サマリー

本研究は、在来の新熱帯サバンナ由来種である Stryphnodendron adstringens 植物抽出物を用いたマグネシウムナノ粒子のグリーン合成プロトコルを記述し、その後化粧品血清製剤として組み込み評価するものです。

要約

本研究は、新熱帯サバンナ原産の 植物種であるStryphnodendron adstringensのエタノール抽出物を用いたマグネシウム系ナノ粒子のグリーン合成プロトコルと、それらをナノフィトコスメティック製剤に組み込むためのプロトコルを説明しています。この手順には、植物材料の収集と準備、その後エタノール抽出が行われ、植物化学物質がマグネシウムイオンの還元・安定化剤として作用します。ナノ粒子はマグネシウム塩化物と植物抽出物を用いて管理された条件下で合成され、有害な還元剤を使わずに環境に優しいプロセスを実現します。ナノ粒子の特性は動的光散乱と原子力顕微鏡を用いて特徴づけられ、サイズ分布、形態、コロイド挙動を評価します。プロトコルはさらに、合成されたナノ粒子を化粧品血清の製剤に組み込む方法についても説明しています。安定性は、オルガノルプ特性、pH、粘度を監視することで制御された保管条件下で評価されます。この方法は、植物媒介のマグネシウムナノ粒子を製造し、化粧品製剤での応用を評価するための再現性かつ持続可能なアプローチを提供します。

概要

セラード植物地理学的ドメインは、南アメリカ最大のネオトロピカルサバンナ層を含み、世界で最も生物多様性の高い熱帯サバンナ地域を表しています。この生態系には、フラボノイド、ポリフェノール、テルペン、フェノール酸などの二次代謝物に富む数千種の植物が生息しており、その多くは化粧品や製薬業界で注目される抗酸化、抗炎症、光保護活性が記録されています。1,2,3,4 .これらのフィトケミカルは、機能性化粧品の製剤において高価値の有効成分として広く取り入れられています。生物学的活性に加え、多くのポリフェノールやフラボノイドに含まれるヒドロキシルおよびカルボニル官能基は、溶液^5,6中の金属イオンの自然な還元・安定化剤として機能します。この化学的特性は、金属ナノ粒子の合成のためのグリーンナノテクノロジーでますます探求されており、新熱帯生物多様性^2,3,4,5,6から派生した持続可能な化粧品製剤の開発において、有望であまり探求されてこなかった機会を示しています。

従来、ナノ粒子(NP)は、レーザーアブレーションやスパッタリングなどの物理的手法を用いてバルク材料をナノサイズの粒子に分解するトップダウンアプローチや、化学的または^{生物学的ルート}を用いてより小さな単位からNPを構築するボトムアップ方式で製造されてきました。化学的・物理的手法は効果的ですが、多くの場合、有害な試薬、高いエネルギー消費、複雑な機器に依存します。これにより、ナノ^{材料生産において}持続可能性、環境に優しさ、安全性を重視するグリーンケミストリー手法が台頭しています。

この枠組みの中で、NPのグリーン合成は大きな注目を集めています。植物植物化学物質が還元、安定化、キャップを同時に作用し、金属および金属酸化物NPの効率的な合成を可能にする能力と、専門的な機器、過酷な条件、有害廃棄物の発生を伴う従来型方法の制約を踏まえ、適度な条件下で動作するグリーン合成プロトコルの開発を正当化する。 有害な副産物を発生させない^6,7,8,9。この戦略で探求された金属酸化物NPの中で、マグネシウムナノ粒子(MgNPs)は銀ナノ粒子(AgNPs)や酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)に比べて大きな利点を持っています。なぜなら、MgNPsは生物蓄積の傾向を示さず、ヒト細胞での細胞毒性が低く、米国食品医薬品局(FDA)によりヒト用途において一般的に安全な物質として認められているからです。¹⁰¹¹。さらに、セラード植物抽出物を用いて合成されたMgNPsは、マグネシウムの抗酸化および抗菌特性と抽出物に含まれるバイオアクティブ植物化学物質を組み合わせることが期待されており、従来の合成製品と比較して見た目の機能価値を高めることが期待されています¹⁰。

化粧品業界では、ナノテクノロジーの応用が有効成分の供給、安定性、有効性を高めることで製品開発に革命をもたらし^ました。NPは皮膚の奥深くに浸透し、コントロールされた放出を提供し、敏感な化合物の劣化から保護するため、肌の老化、色素沈着、ニキビ、日焼^け防止を対象とした処方に非常に価値があります。これらの記録された利点にもかかわらず、新熱帯サバンナの在来植物を還元剤として用いるMgNPsの緑合成は、依然としてほとんど未だに探求されておらず、方法論的標準化も欠いています。これはアジア、アフリカ、ヨーロッパの植物で広く報告されているものとは異なります(11,12,13,14)。.既存のほとんどの研究は、NPの機能的化粧品処方への組み込みや、^{管理された保管}条件下での安定性に限定的な注目を向け^{ています。}本プロトコルは、新熱帯植物相からのMgNPのグリーン合成、ナノフィトコスメティックセラムへの組み込み、そしてその物理化学的および機能的安定性の包括的な評価を単一の再現可能な方法論で統合することで、この方法論的ギャップを埋める助けとなっています。

このプロトコルの全体的な目標は、セラード新熱帯サバンナ原産の 植物であるStryphnodendron adstringensを還元剤と安定剤の両方として用い、MgNPのグリーン合成の標準化され、再現可能かつ拡張可能な方法論を説明し、その内在的なバイオアクティブ特性をフェイシャルセラム製剤で活用することです。 S. adstringens から合成されたMgNPsの開発は、現在ブラジル特許(BR 10 2025 015416 1)で保護されている新規ナノフォーミュレーションを構成しています。提案された実験デザインは、従来のNP合成で一般的に用いられる有害還元剤の使用を避けつつ、生物学的活性を持つ植物化学物質の組み込みを促進する持続可能かつ生体適合性のあるNP生産アプローチを示しています。このプロトコルは、特にフラボノイドやポリフェノールが豊富な植物抽出物が利用可能である場合、化粧品、医薬品、生物医学用途の環境に優しいナノ粒子製造方法を求める研究者に適しています。これらの化合物は自然の還元剤および安定剤として作用するため、プロトコルは同様の植物化学的プロファイルを持つ他の植物種にも容易に適応でき、植物材料の局所的な入手状況に基づいて異なる生物地理学的地域の在来植物相に適用可能です。

プロトコル

1. 植物素材

1. 選定と記録
   1. 樹皮採取には、自然環境の代表的な場所に生育する健康な S. adstringens 植物を選びます。採取場所、採集日、GPS機器を用いた地理座標、採集時の現地環境条件を記録します。
   2. ネオトロピカルサバンナ種の専門的な分類学文献を用いて植物学的同定を行います。資格のある^分類学者に相談して同定を確認しましょう。
   3. 葉、花、果実、小枝などの栄養・生殖構造を含む代表的な植物資料を収集・分離し、標本館の記録に用いられます。
      注: 実験手順に使う樹皮とは別に標本館の資料を収集してください。標準的な標本館の技術で植物素材をプレス・乾燥し、バウチャー標本をマウントし、追跡可能性を確保するために認定された標本館に保管します。
2. 樹皮コレクション
   1. BBCH(Biologische Bundesanstalt、Bundessortenamt、化学工業)の段階31–39でS. adstringensの幹から樹皮を採取し、これは以前の物候学的研究^16,17で記述された栄養成長期に対応します。
      注: 収集した物質は暗い袋に保管し、二次代謝物の分解を防ぎ、二次代謝物の分解を防ぎます。
3. 水分測定
   1. 樹皮サンプルは分析天秤を使って計量します。材料を3つのレプリケートに分け、初期の重さを記録します。
   2. 樹皮サンプルを105°Cのオーブンに入れます。 サンプルを一定の重さになるまで乾燥させます。
      注: 連続した2回の測定値が1mg以内の差がある場合、一定重量が達成され、完全な水分除去を示します。
   3. サンプルをオーブンから取り出し、室温まで冷やし、最終重量を記録します。以下の式を用いて含水率と乾物質を計算します。
      
      乾燥物質(%)=100 - 湿度(%)
      ここで:
      W1 = 空の容器の重量
      W2 = 容器の重量+乾燥前のサンプル
      W3 = 容器の重量+乾燥後の試料

2. 抽出物の調製

注: 有害物質に関わるすべての手順は、国際的に認められた化学物質安全ガイドラインに従って実施^{されました。}

1. 採取したばかりの樹皮は流水で洗い流し、土やほこり、表面の不純物を取り除きます。
2. 樹皮サンプルを36°Cのオーブンで72時間加熱します。乾燥した樹皮をナイフミルで粉砕し、細かい粉末を得ます。
3. 200gの樹皮粉を重くして、エルレンマイヤーフラスコに移します。98%エタノールを1000mL加えます。
   注意: エタノールは非常に可燃性が高いです。引火源から離れた場所で取り扱い、換気の良い場所で作業してください。
4. フラスコを密閉し、室温で72時間、光から守って保管してください。混合物を24時間ごとに1回攪拌してください。
5. まず金属メッシュで抽出物をろ過し、その後漏斗を使って綿で残留物を除去します。

3. 抗酸化活性の評価

1. メタノールに100 mM DPPH(2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル)溶液を準備します。
   注意: メタノールは有毒で非常に可燃性が高いです。フードに持ち込み、適切な個人用防護具を着用してください。 DPPHは刺激性があり、吸入や摂取すると有害になる可能性があります。直接接触や吸入は避けてください。
   注: 暗い環境でアッセイを行い、光から溶液を保護し、メタノールとDPPHの取り扱いには必ず手袋を着用して注意してください。
2. エタノールである S. adstringens の樹皮抽出物をメタノールで希釈し、0.1%から5%(v/v)の範囲の濃度を得ます。陽性対照と同じ濃度でビタミンC溶液を準備してください。
3. 96ウェルプレートの各ウェルに100μLのDPPH溶液を注ぎます。
4. 各ウェルに50μLの抽出液またはビタミンC溶液を加えます。
   注: 陰性コントロールとしてDPPH+メタノールを使い、ブランクとしてメタノールのみを使います。すべての測定は四重に行ってください。
5. 皿を室温の暗い場所で30分間孵化させます。
6. 分光光度計を使って515 nmの吸収を測定します。
7. 以下の式を用いてラジカルスカベンジング活動を計算します。
   
   ここで:
   ABS制御=DPPH+メタノールの吸収
   ABSサンプル=DPPH吸光+抽出物

4. 細胞生存率分析

1. RPMI-1640培地で正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を培養し、胎児用牛血清10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足しました。細胞は37°C、CO₂5%で維持します。
2. 細胞を96ウェルプレートに3×〜10個、⁴ 個のセル/ウェルで種付けし、24時間培養します。
3. 培地を100μLの新鮮培地に置き換え、抽出液50μLを加えます。24時間潜伏させます。
4. 培地を取り出し、各ウェルに10μLのMTT溶液を加えます。フォーマザンの形成を待つために4時間の培養を行います。
   注意: MTT試薬は有毒であり、手袋と適切な防護具を着用して取り扱うべきです。肌や目を合わせるのは避けましょう。
5. 結晶を溶かすために60μLの溶解溶液(イソプロパノール中のHCl)を加えます。
   注意: 塩酸は腐食性があり、重度の火傷を引き起こすことがあります。適切な防護具を装着し、排気フード内で作業してください。イソプロパノールは可燃性であり、着火源から離れた場所で換気の良い場所で取り扱うべきです。
6. 分光光度計を使って540 nmの吸収を測定します。
   注: 細胞生存率アッセイは、処理済みおよび未処理対照群を対象に実施され、各状態は四重ウェルで分析されました。
7. 細胞生存率を以下を用いて計算します:
   細胞生存率(%) = (ABSサンプル抽出物/ABS細胞制御)×100
   ここで:
   ABSセルコントロール=細胞および培地を含む未処理コントロールウェルの吸収。
   ABSサンプル抽出物=植物抽出物で処理された細胞を含む井戸の吸収。

5. マグネシウムナノ粒子のグリーン合成

1. 滅菌反応管に蒸留水9890μLを加えます。
2. 植物抽出物100μLを加えます。
3. 10 μLの1 M MgCl₂を加えると、最終濃度は10 mMとなります。
   注意: 塩化マグネシウムは刺激を引き起こすことがあります。適切な保護具を着用し、目や皮膚への接触を避けてください。
   注: 塩基反応は1%(v/v)エキス+10 mM MgCl₂、10 mLの総体積から構成されます。NP生成を最適化するために、抽出物濃度を調整しつつ最終体積とMgCl₂濃度を維持することができます。
4. 溶液を均質化するためによく混ぜます。
5. 75°Cで18時間孵化します。
   注意: 高温は火傷を引き起こすことがあります。加熱されたサンプルを扱う際は適切な保護具を使用してください。
   注: 色の変化はナノ粒子の形成を示すことがあります。
6. 特性評価を行う前に、混合物を室温まで冷やしてください。

6. ナノ粒子特性評価

1. 動的光散乱(DLS)
   1. 測定セルに~750μLのナノ粒子懸濁液を移します。
   2. セルを機器に挿入し、25°Cで測定を行います。
   3. 適切な検出モードを用いて粒子サイズデータを取得します。
   4. 各サンプルを3回ずつ分析し、1回の測定ごとに5回のサブランを行います。
2. 原子間力顕微鏡(AFM)
   1. 新しく切断された雲母に10μLのナノ粒子懸濁液を浸着します。
   2. サンプルを乾燥機で2時間乾燥させます。
   3. 雲母シートを20μLのろ過蒸留水で優しく3回洗い流します。サンプルを乾燥機に戻し、室温でさらに2時間乾燥させます。
      注: すすいで余分な塩分を取り除き、画質が向上します。
   4. メーカーの指示に従って機器のセットアップとレーザーアライメントを行い、原子間力顕微鏡を構成します。500×500 nmのスキャン面積を持つNPの表面画像を取得します。
      注: AFMは表面粗さを定性的に評価し、 S. adstringensから合成されたMgNPsの形態的特徴を可視化し、高解像度の三次元表面画像を生成するために使用されます。

7. ナノ植物美容の製剤

1. 加熱相
   1. 浄化水29.7g、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、グリセリン3gを別々の容器に重みます。
   2. 水を磁気かき混ぜ棒に入れ、優しくかき混ぜて70〜75°Cまで加熱します。
   3. 固まらないように、かき混ぜながらHECを徐々に加えます。
      注意:水分補給には15〜30分かかる場合があります。
   4. グリセリンを加え、均一になるまで混ぜます。
2. クールダウンフェーズ
   1. 別々のビーカーで、冷却段階には精製水30g、ナイアシンアミド3g、 S. adstringensから合成されたMgNPs33.3g、低分子量ヒアルロン酸0.3g、ベンジルアルコールおよび脱水素酢酸0.2gを充填します。
   2. ナイアシンアミドを完全に室温の水に溶かします。
   3. ヒアルロン酸を加え、均一になるまで混ぜます。
   4. S. adstringens MgNPを加え、優しく混ぜます。
   5. 防腐剤を加えて混ぜます。
3. ミキシング
   1. 加熱相を~40°Cまで冷却します。
   2. かき混ぜながら、冷却フェーズを加熱フェーズにゆっくり加えてください。
   3. 処方のpHを測定してください。ナイアシンアミドを含む血清製剤の場合、ターゲットpHは5.0〜6.5が適切です。
      注: ナイアシンアミドは中性からやや酸性のpH付近で安定しています。必要に応じて少量のクエン酸や水酸化ナトリウムを使ってpHを調整してください。

8. 外観安定性の評価

1. 予備的安定(12日間)
   1. 化粧品血清の複製サンプルを4つ密封容器に入れて準備してください。
   2. サンプルを6回連続で凍結・解凍サイクルにかけます。サンプルは50°Cで24時間保存し、その後−5°Cで24時間保存し、48時間ごとに1サイクルを完成させます。
   3. 各サイクル終了後、形状、色、臭い、相分離の変化を視覚的に検査してオルガノルプ的特性を記録します。
   4. 4つの試料のpHを室温で測定し、校正済みのデジタルpHメーターを使用します。機器メーカーの指示に従って回転粘度計を使って粘度を測定してください。
      注: 10%≤バリエーションも許容されます。この閾値を超える変化は製剤の不安定性を示す可能性があり、さらなる調査が必要です。もし配合が予備試験に合格すれば、加速安定性アッセイを実施します。
2. 加速安定(90日間)
   1. 化粧品の製剤を8サンプル用意してください。4つのサンプルを50°Cで、4つのサンプルを4°Cで保存します。
   2. 0日、1日、7日、15日、30日、60日、90日で評価してください。
   3. 形状、色、臭い、相分離の変化を視覚的に検査することで、オルガノルプティック特性を評価・記録します。
   4. 課正されたデジタルpHメーターを用いて室温で試料のpHを測定します。機器メーカーの指示に従って回転粘度計を使って粘度を測定してください。
      注: 安定性評価は、ブラジル保健監視庁¹⁹が定めたガイドラインに従って実施されました。アメリカ合衆国では、安定性試験はFDAの勧告²⁰に従って行われます。欧州連合では、安定性評価は化粧品安全報告書(CPSR)の包含を義務付ける規則(EC)第1223/^{2009 21}号に準拠しています。この規則の付属書Iでは、化粧品配合の安全性と保存期間を支えるために安定性データの文書化が求められており、試験は一般的に調和ガイドラインISO/TR 18811:²²「化粧品の安定性試験に関するガイドライン」に従って実施されます。

結果

植物樹皮の乾燥工程は、生物活性化合物を保存し、食品、医薬品、化粧品産業での適用性を確保する上で極めて重要なステップです。逆に、乾燥が不十分だと過度な暗色、香りの喪失、微生物による汚染、生物活性成分の劣化を引き起こし、生樹皮の品質が損なわれることがあります。 表1は 、適切に乾燥された植物材料と不適切に乾燥された植物材料を区別するための基準をまとめたものです。

これらの要因を合わせると、適切な乾燥は単なる保全技術ではなく、フェノール化合物を豊富に含み、潜在的な美容用途を持つ植物の機能的かつ産業的価値を維持する決定的な要素であることを強調しています。適切な乾燥は水分含有量を安全なレベルに減らし、微生物の増殖を防ぎ、フェノール化合物、タンニン、フラボノイドの完全性を維持します。これらは抗酸化能力23,24,25に直接関係しています。

ディスカッション

ここで示すプロトコルは、S. adstringens抽出物を用いたMgNPのグリーン合成と、それらをナノフィトコスメティック血清製剤に組み込むための再現可能なワークフローを説明しています。信頼できる結果を確保するためには、いくつかの重要なステップがあります。まず、植物の採集と記録は厳密に標準化され、地理座標、環境条件、フェノロジー段階の正確な記録が含まれる必要があります。植物の生理学や二次代謝物含有量の変動は抽出物の組成に直接影響し、したがってNP還元および安定化の効率に影響する可能性があるからです。^16,17。

含水率は基本的なパラメータであり、植物材料中の過剰な水分は化合物の化学的・微生物的分解を促進し^、抽出物の標準化と安定性を損なう可能性があります。このため、加工中の水分レベルを監視することは再現性を確保するために重要です。植物...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	シグマ・オルドリッチ	M0812	細胞アッセイ
ベンジルアルコールと脱水素酢酸	シグマ・オルドリッチ	1,09,626	防腐剤
遠心分離機チューブ(15 mL / 50 mL)	ファルコン(コーニング)	430766	サンプル取り扱い
クエン酸	シグマ・オルドリッチ	C0759	pH調整
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	3110	細胞培養に使用されるCO2インキュベーター
綿のフィルター素材	現地サプライヤー	LH R/260	ろ過
乾燥器	メルク 	BAF424002141	乾燥
DPPH(2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル)	シグマ・オルドリッチ	D9132	抗酸化アッセイ
乾燥オーブン	ノヴァ&イーキュート;ティカ	400/5NDR	植物材料の乾燥用オーブン
イージーオーブン	ソリッドスチール	SSE-85L	外観安定性測定に使われるオーブン
エルレンマイヤーフラスコ 1000 mL	ビドロラボ	76200B01000	抽出
エタノール(98%)	ディナミカ・キミカ・コンテンポラネア	P.10.0051.015.36	抽出溶媒
胎児用牛血清(FBS)	Gibco(サーモフィッシャー)	ES-009-C	補遺
冷凍庫	ゲロパー	GTPC-575	安定性測定に使われる冷凍庫
グリセリン	ボッティカ・ボタニカ	TBV084.003904.086	保湿剤
ヒアルロン酸(低分子量)	ボッティカ・ボタニカ	J201220136	加水剤
塩酸(HCl)	シグマ・オルドリッチ	1,00,317	MTT可溶性
ヒドロキシエチルセルロース(HEC)	ボッティカ・ボタニカ	AH230641697	増粘剤
イソプロパノール	シグマ・オルドリッチ	100995	MTT可溶性
ナイフミル	7LAB	920ウィリー4&タイムズ;4枚の刃	葉、根、種子、塊茎の粉砕
塩化マグネシウム(MgCl2)	シグマ・オルドリッチ	1,01,872	ナノ粒子合成
磁気攪拌機およびダッシュ;ホットプレート	イカ	5030000	ミキシング
メタノール	シグマ・オルドリッチ	900641	DPPHアッセイ
雲母シート	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	NC9655733	AFM準備
マイクロプレートリーダー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	マルチスカン GO 1510-03581	マイクロプレートリーダー
MTT試薬	シグマ・オルドリッチ	CT01-5	細胞生存率アッセイ
NHDFセル	BCRJ	0089	ヒトの皮膚線維芽細胞
ナイアシンアミド	ボッティカ・ボタニカ	211847	有効成分
オーブン	テルモ・サイエンティフィック	PR305225M	乾燥
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン	Gibco(サーモフィッシャー)	15140122	抗生物質
pHメーター	デジメッド	DM-220	安定性アッセイにおける単調pH測定に使用
ピペットとチップ	エッペンドルフ	30078551	液体取り扱い
浄化・蒸留水	メルク(ミリQ)	ZIX7010T0C	一般的な使用
冷蔵庫	メタルフリオ	VB40W	安定性測定に使われる冷蔵庫
回転粘度計	ノボテスト	VISC-5SA	安定性アッセイでの粘度測定に使用
RPMI-1640 ミディアム	Gibco(サーモフィッシャー)	11875093	細胞培養
スケール	BEL Engeneering	HPBG-2285	材料の計量用スケール
走査型プローブ顕微鏡	島津	SPM-9700HT	AFM(走査型プローブ顕微鏡)
水酸化ナトリウム(NaOH)	ディナミカ・キミカ・コンテンポラネア	P.10.0594.024.00	pH調整
分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A51119700C	吸収
ビタミンC(アスコルビン酸)	シグマ・オルドリッチ	PHR1008	ポジティブコントロール
ゼタサイザー・プロ	マルバーン・パナリティカル	ゼタサイザー・プロ	動的光散乱とゼータサイズの場合