懸濁T細胞および3D細胞モデルにおける低入力CRISPRゲノム編集およびmRNAトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

サマリー

このプロトコルは、一次ヒトT細胞におけるTCRα/β受容体の微型CRISPR–Cas9ゲノム編集を、デジタルマイクロ流体(DMF)エレクトロポレーションプラットフォーム「DMF-ection」を用いて説明しています。この方法は並列で低入力の遺伝子編集を高生存率で可能にし、さらにmRNAの多細胞3D球体への送達にも適応可能です。

要約

デジタルマイクロ流体(DMF)電気穿孔は、細胞入力を最大100倍に抑えつつ、哺乳類細胞の精密かつ低ボリュームの遺伝子操作を可能にします。本研究は、一次ヒト懸濁T細胞におけるTRAC遺伝子座のCRISPR介接ノックアウトおよび三次元HEK293T球体のmRNAトランスフェクションにおける高スループットDMFベースのトランスフェクションワークフローを提示します。空間的に沈着したCRISPRガイドRNAとオンカートリッジリボ核タンパク質(RNP)アセンブリを用いて、CD4⁺およびCD8⁺ T細胞群の両方で、1条件下10,000個の細胞で効率的な TRAC 位座破壊が達成され、後編集の生存率は85%を超えました。フロー誘導解析およびテイラー分散解析を用いた生物物理的特徴付けにより、ポリマー添加剤は電気孔槽バッファー条件下でCas9–sgRNA複合体を安定化させ、サブマイクロリットルの体積での再現性編集を支持することが明らかになりました。さらに、EGFP mRNAを完全なHEK293T球体に送達することで、3D応用にも適応され、球状体の成長や形態を損なうことなく、堅牢で空間的に均一な蛍光が得られました。これらの結果を総合すると、DMFエレクトロポレーションが懸濁免疫細胞および多細胞球体の両方で効率的なゲノム編集とmRNA送達を可能にすることを示しています。このプラットフォームは、CAR-T細胞療法、機能ゲノミクス、高度な3D細胞モデルへの応用において、スケーラブルで低入力のソリューションを提供します。

概要

一次ヒト細胞における遺伝子編集は、免疫工学、希少疾患モデリング、機能ゲノ^{ミクスなど}、治療開発と基礎研究の両方においてますます中心的な役割を果たしています。エレクトロポレーションは高効率なゲノム編集を可能にしますが、従来のキュベットベースのシステムは通常、1つの疾患ごとに最大数百万の細胞を必要とし、患者由来のサンプルや希少な免疫集団への利用が制限されます²。さらに、これらのシステムはスループット、自動化、試^薬消費量の制限により大規模なスクリーニングには適していません。

マイクロ流体電気孔育は、低入力ゲノ^ム編集の有望なアプローチとして浮上しています。しかし、既存のプラットフォームの多くは、複雑な流体取り扱いを伴う連続流アーキテクチャに依存しており、試薬混合の柔軟性が限られ、条件あたりのセル要件は比較的高いです。これに対し、デジタルマイクロ流体(DMF)は平面電極アレイ上の離散的なナノリットルスケールの液滴を能動的に操作し、反応組成、タイミング、空間的局在を精密に制御することを可能にします。このプラグアンドプレイのドロップレットベースのフォーマットは、一次細胞や試薬の保存^{が不可欠な低}ボリューム・高スループットのワークフローに非常に適しています5。

最近の研究では、三滴電弧電気穿孔アーキテクチャを用いたDMFを用いた細胞内送達の実現可能性が示されており、局所的で低電流の電場を生成し、効率的なRNPおよびmRNAの送達を行い、熱的および電気化学的ストレスを最小限に抑えています^6,7,8。この基盤の上に、次世代のDMF電気孔化プラットフォーム「DMF-ection」が開発されました。これは48の独立アドレス可能な反応部位、完全な自動化互換性、そして拡張可能なカートリ^{ッジ製造9}(図1)を備えています。DMFカートリッジは、下部PCBプレートとプラスチックトッププレートがガスケットで区切られ、アライメントスナップで単一の正しい向きで組み立てられています(図1A)。48プレックスのレイアウトは8つの同一ファミリー(図1A–H)に構成されており、それぞれ6つの独立してアドレス可能な電気穿孔部位を含み、カートリッジあたり最大48の並列編集条件をサポートします(図1B)。ガイドRNAライブラリーは、カートリッジ組み立て前に音響ディスペンサーを使って基質表面に堆積されます。48か所すべてで位置の沈着精度が確認され、ドロップ位置は電極中央点からサブミリメートルの偏り以内に集まり(図1C)、信頼性の高いオンカートリッジRNPアセンブリを支持しました。装填後、セルと液体電極液滴がオンカートリッジで作動され、三滴電弧形状が形成されます(図1D)。電気穿孔後、細胞は培養プレートにオフロードされ、回収およびフローサイトメトリー、シーケンス、顕微鏡検査を含む下流解析を行います(図1E)。このシステムは、標準的なキュベットベースの手法に比べて最大100倍少ない細胞数で高効率なゲノム編集を可能にし、低入力かつ高スループットの応用におけるゲノム工学へのアクセスを大幅に拡大します。

本研究では、mRNAおよびCRISPR–Cas9リボ核タンパク質(RNP)複合体を含む複数の生体分子貨物を送達することでプラットフォームの性能を評価し、効率的なトランスフェクションおよび遺伝子破壊を実現しています。一次T細胞に加え、DMF誘導は核酸を複雑な多細胞構造に届ける汎用的な枠組みを提供します。三次元(3D)球体やオルガノイド型モデルは、その構造と脆弱性の関係から試薬の浸透に大きな障壁を課し、従来の電気穿孔法は形態を乱したり、不均一な送達を生じさせたりすることが多いです。T細胞編集に用いられるのと同じ小型電気穿孔原理が構造組織にも適用されるかどうかを評価するため、DMFワークフローを3D HEK293T球体に適用しました。これらの実験により、DMFベースの電気湿潤法が三滴形状内に無傷の球体を優しく配置し、構造と成長を保ちつつ均一なmRNA送達を支えることが示されました。これらの結果はここで述べた主要なT細胞プロトコルの外ですが、新創薬や疾患モデリングに関連する新興3D細胞システムに対するプログラム可能なDMF電気孔解のより広範な応用可能性を示しています。

プロトコル

本プロトコルで使用される一次ヒトT細胞は、インフォームドナーの同意のもと、適用される機関的、倫理的、規制ガイドラインに準拠した商業供給者から取得されました。ヒト由来生物材料のすべての取り扱いは、機関のバイオセーフティプロトコルに従って行われました。このプロトコルを実施する研究者は、一次ヒト細胞の使用が地域の機関審査委員会(IRB)または倫理委員会の要件、適用されるバイオセーフティ規制、およびヒト生物材料の使用を規定する関連する国または地域の法令に準拠していることを保証します。本研究で使用された細胞材料には患者を特定できる情報は一切認められませんでした。

1. 一次ヒトT細胞の調製および活性化

1. ヒトの一次CD3⁺ T細胞を37°Cの水浴で迅速に凍結保存します。細胞を予温した基底T細胞培地に移し、180× g で10分間遠心分離します。上澄液を捨て、ペレットを新しい培地に再懸濁させます。
2. 自動細胞計数器を用いて細胞濃度と生存率を測定します。
3. 細胞を1〜10×^6細胞/ mLで再懸濁し、T細胞培養培地に可溶性四量体抗体CD3/CD28 T細胞活性化刺激(ベンダー指示に従い)と200 IU/mLのIL-2を補足します。細胞を37°C、5% CO₂で72時間培養します。
   注意:活性化時は細胞密度を0.5〜2×10⁶ cells/mLの範囲に保ってください。U底96ウェルプレートで活性化を行い、細胞とアクチベーターの接触と活性化効率を最適化します。

2. DMF基質上のガイドRNAスポットの準備(音響ディスペンサースポッティング)

1. ヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥したsgRNAを100μMのストック濃度に再構成します。別のチューブで、ヌクレアーゼフリー水にポリL-グルタミン酸(PGA、ナトリウム塩、MW 15,000〜50,000 Da)を100 mg/mLのストックで準備します。sgRNAとPGAストックを5:4の体積比(sgRNA: PGA)で組み合わせると、最終sgRNA濃度は55.6 pmol/μL、最終PGA濃度は44.4 mg/mLとなり、ヌクレアーゼフリー水に表されます。ボルテックスを短時間、遠心分離機で1,00×0 g で30秒間遠心分離し、使い捨ての量に分割し、未使用の分量は−80°Cで最大6か月間保存します。
   注意:繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。
2. ガイドPGA混合液を、目的の反応部位配置に対応するウェル内の低デッドボリューム音響源板に加えます。
3. ガイド-PGA混合物の40 nL(2.2 pmol sgRNAに相当)を、校正済みの音響ディスペンサーを使ってDMF基質の各ターゲットスポッティング領域に移します。
   注:55.6 pmol/μLの場合、40 nLは1サイトあたり2.2 pmolのsgRNAを供給します(55.6 × 0.040 = 2.22 pmol)。ドライガイドはドロップレットマージオンカートリッジの際に再構成されます。完全な停止は、各サイト間の編集効率の一貫によって確認されています。
4. 生物安全キャビネット内で、斑点滴を室温で完全に自然乾燥させ、目に見える液体がなくなるまで約5分間待ります。
   注意:強制的な空気の流れや加熱は使わないでください。ガイドRNAが外れたり劣化したりする恐れがあります。
5. DMFカートリッジを組み立てます。
   1. 生物学的安全キャビネットでは、トッププレートの非対称プラスチックのスナップ機能を下板の切り欠きに合わせて、スポット付き基材の上にトッププレートを合わせます。短辺に沿って均等に同時に圧力をかけ、明確な機械的なスナップ音を感じてロック機能が完全に噛み合うことを確認します。
      注:カートリッジは単一の正しい向きで設計されています。誤った組み立てではスナップは発生しません。基材は常に縁を押さえて、機能的な表面への汚染や損傷を防ぎ、基材同士が滑り合うと表面コーティングに傷がつく恐れがあります。
   2. チェックポイント:機械式のスナップで正しい組み立てを確認しましょう。
      注:コーティングの完全性を示す事前電気的インジケーターはありません。不適切な組立による機能的故障は自動的に検出され、実行後のQCレポートで報告されます。
      一時停止:未使用の組み立てカートリッジを乾燥剤(シリカゲルパック)とともに密封したパッケージに入り、室温で最大48時間保存します。

3. 細胞の製造

1. 使用前にDMF互換電気穿孔バッファーと付属の生体適合性非イオン界面活性剤を20:1(v/v)比率で混合し、最終界面活性剤濃度0.05%(v/v)で1mLの完全トランスフェクションバッファーを準備してください。優しく混ぜて、氷のままにしてください。
   注:ここで使用されているDMF互換トランスフェクションバッファーは、低伝導率の等張バッファー(導電率:3.5 mS/cm、浸透圧:305 mOsm/L)です。代替バッファーを使用する研究者は、DMF作動および細胞の生存可能性との適合性を検証すべきです。生体適合性のある非イオン界面活性剤は、液滴固定を減らす役割を果たします。もし提供された界面活性剤が使われない場合は、適切な代替品を用いてください。
2. 活性化T細胞をトランスフェクションバッファー(界面活性剤なし)で一度洗浄します。180 × g で遠心分離機を5分間行い、上清液を吸引し、細胞ペレットを完全トランスフェクションバッファー(界面活性剤を含む)に1.0 × 10^{7 cell/} mLで1カートリッジあたり100 μLの総容量で再懸浮させます。冷やしておけ。
3. カートリッジに装填直前、Cas9ヌクレアーゼを100μLのTセル懸濁液に直接加え、優しくピペッティングして混合します。氷をつけておけ。
   注:一次T細胞の場合、Cas9は100μLカートリッジ容量あたり42pmol(0.42pmol/μL)で充填されます。各電気孔離脱部位は約1μLの細胞懸濁液を処理し、1回の編集で0.42 pmolのCas9を供給します。他の免疫細胞タイプに適応する際にはこの用量を最適化してください( 表1参照)。

構成要素	編集ごとの最終濃度
Cas9	0.42 pmol ⁴ ⁒ ⁻¹ μL 液滴
sgRNA	2.1 pmol(40 nLスポットから)
PGA	スポッティングミックス中の44.4 mg/mLストック
界面活性剤	0.05%(v/v)
セル入力	~10,000セル

表1:各トランスフェクションドロップレットの最終濃度の要約表。

4. DMF生成プラットフォーム上のトランスフェクション

1. マルチチャネルピペットを用いて、Tセル/Cas9混合液を8セルのローディングポートそれぞれに10μL、完全なトランスフェクションバッファー10μLを16の液体電極ローディングポートに注入します( 図 1参照)。
2. 電圧を500Vに、パルス持続時間を3ms、パルス数を2に設定します。プラットフォームの指示に従って電気穿孔シーケンスを開始してください。
   1. チェックポイント:ラン終了直後にQCレポートを確認してください。断続的な失敗(<10%)は介入を必要としません。故障が一定の場合は、付属のQCボードにカートリッジを交換し、システムヘルスチェック(約2分)を実行し、問題が解決しない場合は技術サポートに連絡してください。

5. 編集されたT細胞のオフロードと回収

1. 液体ハンドラーを用いて、各反応部位から電解孔出した細胞を、150μLの予温基底T細胞培地に200 IU/mLのIL-2を補足した96ウェルのU型底板に移します。
2. 細胞を37°C、5%のCO₂で72時間培養し、タンパク質のターンオーバーと表面受容体の発現変化を促します。

6. TRAC ノックアウトのフローサイトメトリー解析

1. 洗浄間の細胞損失を減らすために、無菌の96ウェル円錐形底板に細胞を移します。400 × g で遠心分離し、円錐形底板を優しく反転させて上清液を除去し、フローサイトメトリーバッファー(1× PBS、2% FBS、2 mM EDTA)で2回洗浄します。細胞はプレート内にペレット状のまま残ります。
2. 製造者推奨濃度で、抗CD4、抗CD8、抗TCRα/β抗体を含むフローサイトメトリーバッファー内の表面染色マスターミックスを準備します。1ウェルあたりマスターミックス25μLを加え、光を遮った4°Cで20分間培養します。1×PBS(FBSなし)で400 × g で遠心分離して5分間2回洗います。細胞を1:1,000(v/v)の生存性染料を含む1×PBS100μLに再懸浮させ、光を遮断した室温で10分間培養します。
   注:円錐形の底板は細胞のペレット化に効果的です。すべての段階でセルがしっかり再懸浮されているか確認してください。
3. フローサイトメトリーバッファーで2回セルを洗浄し、1サンプルあたり150〜200μLで再懸濁して取得します。
4. 使用するフルオロクロムに合わせた適切なレーザーラインとフィルターセット(例:バイアビリティ染料用488nm励起、表面マーカー用405nmまたは488nm)を組み合わせてサイトメーターを構成します。単一染色補償制御と染色されていないサンプルを使って電圧を設定します。サンプルあたり最低5,000件のライブシングレットイベントを収集してください。順次ゲートを生細胞→散点する単粒(生存性染料陰性)→→TCRα/β発現。
   注:標準条件下では、細胞が増殖する時間が経っているため、洗浄や染色による損失後、サンプルあたり5,000から10,000以上の生反応が集まることがあります。
5. CD4⁺およびCD8⁺集団内でTCRα/β陰性細胞の頻度を測定することで TRAC 遺伝子破壊を特定します。ノックアウト効率を、各サブセットにおけるTCRα/β陰性細胞の生存シングルレットゲートに対する割合として報告します。

結果

期待される結果
1つの状態につき10,000個の活性化されたT細胞を電気分孔すると、通常は TRAC ノックアウト効率>85%、移植後72時間で生存率>95%となります。フローサイトメトリーでは、TRAC標的条件下でTCRα/β染色が非標的sgRNA対照群(NTC)および電場にさらされていない対照群に比べて明確に失われていることが明らかになりました。特に明記がない限り、nは独立したDMF選択ランが別々の日に行われることを意味します。同じカートリッジの技術的な再現は統計解析前に平均化され、nに独立して寄与しません。ここで報告されたすべてのT細胞実験は、単一の健康なドナーから得られたクリオ保存細胞を用いて行われました。同じプラットフォームを用いたドナー間変動はさらに^特徴付けられています。

陰イオン性ポリマー添加剤による電気ポレーション条件下でのCas9–sgRNAリボ核タンパク質の安定性の向上

ディスカッション

このプロトコルは、ナノリットルスケールの液滴を用いて一次ヒトT細胞への効率的な細胞内送達を可能にする小型化されたデジタルマイクロ流体電気穿孔ワークフローを説明しています。この方法の中心的な利点は、1回の反応でわずか10,000個の細胞でCRISPR–Cas9ゲノム編集を行うことができ、従来の電気穿孔に比べて材料の必要量を大幅に削減できることです。ドロップレットベースのアーキテクチャは自動化をサポートし、複数の並列サイト間での試薬取り扱いと反応組み立ての再現性を確保します。

過去の研究では、DMFエレクションプラットフォームを広く使われているシステムと直接ベンチマークした結果、従来のヌクレオフェクションは1回の編集で10,000個の細胞で2%未満のGFP陽性T細胞を産生し、DMFエクションプラットフォームは同じ低入力条件下で>90%のトランスフェクション効率を達成しました。192条件の配列スクリーンにおいて、DMFプラットフォームは従来の手法⁹に比べてセル数が25倍少な...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	機器類
1x PBS	Gibco		フローバッファ
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	スフェロイドプロトコル
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	スフェロイドプロトコル
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		機器類
DMEM Media	Gibco	10564011	培地サプリメント- スフェロイド培養
DMF compatible buffer	DropGenie		トランスフェクション
DropGenie Transfection System	DropGenie		機器類
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		フローバッファ
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		機器類
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	培地サプリメント- スフェロイド培養
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		機器類
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		スフェロイドプロトコル
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T 細胞培地サプリメント
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		末梢血、凍結保存済み、pan CD3+ヘルパーT 細胞、ネガティブ選択済み
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T 細胞活性化培地
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T 細胞活性化培地
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		機器類
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	機器類
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	培地サプリメント- スフェロイド培養
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/mlで使用
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		ソフトウェア
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	スフェロイドプロトコル
Surfactant F	DropGenie		トランスフェクション- DMF 互換バッファ1:20で使用し、完全なトランスフェクションバッファを作る
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	スフェロイドプロトコル