HEK293細胞におけるスプリット発光タグを用いた生存細胞mRNA翻訳ダイナミクスの測定

サマリー

本稿では、分割発光タグを用いてHEK293細胞内での生細胞mRNA翻訳ダイナミクスを測定する、柔軟でハイスループットに対応した手法を提示します。この多用途なアッセイは、構造的影響の区別を可能にし、in vitro 転写の最適化をサポートし、mRNA治療薬の開発を効率化します。

要約

COVID-19に対抗するための迅速なワクチン開発は、メッセンジャーRNA（mRNA）治療薬が創薬を変革させる可能性を示しました。成熟したmRNAと同様に、in vitro転写mRNAは、5’キャップ、非翻訳領域（UTR）、コーディング配列、およびポリ(A)テールを含む同一の要素を備えています。これらの構成要素がmRNA翻訳に及ぼす影響を研究した先行研究では、主に、効率的な翻訳とタンパク質安定性を示す高度に設計されたレポータータンパク質が利用されてきました。各mRNAの構造要素が翻訳に異なる影響を与えるため、目的の治療用タンパク質（POI）に関連する最適な設計を特定することが不可欠です。POIの翻訳特性を評価するため、スプリットルシフェラーゼ相補系が採用されました。POIのいずれの末端にも融合させることができる短鎖ペプチドタグ（HiBiT）は、細胞透過性基質が存在する状態で、その相補的なヘテロ二量体（LgBiT）と結合し、酵素活性を再構成します。これまで、スプリット発光タグ付けは主にハイスループットなタンパク質ターンオーバー研究に使用されてきました。我々は以前、相補的ヘテロ二量体を恒常的に発現させたHEK293細胞において、スプリット発光タグ付けを用いてmRNA翻訳をin celluloで経時的にハイスループット定量化できることを実証しました。本研究では、このアッセイの汎用性をさらに実証し、コスト削減のためにin vitro転写を最適化する方法を詳述します。このアッセイシステムは、非設計遺伝子を用いてコーディング配列最適化の効果を明確にする一方で、構造構成要素の変化を独自に区別することが可能です。さらに、in vitro転写における5’キャップ濃度を4分の1に減少させても、in celluloでの翻訳量は同等であることを示します。これらの知見は、スプリット発光タグ付けをmRNA治療のワークフローに容易に組み込めることを示しており、in celluloでのmRNA駆動性タンパク質発現ダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にし、mRNAベースの治療薬の進展に向けた汎用性の高い手法を提供します。

概要

メッセンジャーRNA（mRNA）治療法および研究への応用は、mRNAワクチンの成功^1,2と、プログラミング可能な生体分子としてのRNAの汎用性への認識の高まりにより、近年急速に拡大しています。この分野における中心的な課題は、多様なコンテキストにおいてmRNAの翻訳効率を定量的かつ動的に評価できる能力にあります。本手法では、分割発光タグシステムを活用することで、細胞内（in cellulo）での生きたmRNA翻訳を研究するための柔軟で拡張可能なプラットフォームを提供します³。本手法の全体的な目的は、配列上の特徴、化学修飾、および構造的要素が翻訳速度論およびその後のタンパク質代謝回転にどのように影響するかを研究者が測定できるようにすることであり、これにより、治療および基礎科学への応用のためのmRNA構築物を最適化する強力なツールを提供します。

In vitro転写されたmRNAは、5′キャップ、非翻訳領域（UTR）、コーディング配列、およびpoly(A)テールを備え、成熟転写物の重要な構造を模倣しており、免疫原性を低減させるために修飾ヌクレオチドが含まれることが多い^4,5。広範な研究により、これらの各要素が単独で、あるいは組み合わせによって、翻訳効率とタンパク質収量に強力に影響を与えるよう設計可能であることが示されている^6,7。しかし、先行研究の多くは、緑色蛍光タンパク質（GFP）⁷、NanoLuc⁸、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質^8,9などの高度に最適化されたレポータータンパク質に依存していた。これらは高い効率で翻訳され、非常に安定したタンパク質を産生するように設計されており、そのため治療上の文脈で直面する課題を反映していない。治療用mRNAは、それぞれ独自の構造的制約や細胞型特異的な制御を受ける多様な目的タンパク質（POI）をコードするため、ある構築物で翻訳を最大化する設計原理が別の構築物に一般化できるとは限らず、これは既報の通りである³。したがって、特定の治療用POIにとって最適な構成を特定することは不可欠であり、転写物の個々の特徴がタンパク質出力にどのように寄与するかを感度高く、かつ系統的に評価できる手法が必要である。

ポリソームプロファイリングなどのリボソームに焦点を当てた手法では、密度勾配遠心法を用いて翻訳分画を区別しますが¹⁰、リボソームプロファイリング（Ribo-seq）では、リボソームの占有率、開始部位、およびポーズをヌクレオチドレベルの解像度で提供します¹¹。Ribo-seqと同様に、架橋免疫沈降によるRNA単離の高スループットシーケンシング（HITS-CLIP）や翻訳リボソームアフィニティー精製（TRAP）などの他のシーケンシングベースのアプローチにより、RNA結合タンパク質関連またはリボソーム関連RNAの翻訳をさらに特性解析できます¹²。これらの手法は強力ですが、複雑な調製、専門的な装置、および計算科学的な専門知識を必要とするため、高スループットな治療用mRNAの開発には適していません。新生鎖免疫沈降法¹³では、リボソームから免疫沈降させたFLAGタグ付きタンパク質を用い、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）で定量することで、翻訳効率を測定します。このアッセイは治療用mRNAにも適応可能ですが、手間がかかり、時間分解能に欠け、高スループットなアプリケーションには不向きです。SunTagシステム¹⁴は、単一のmRNA分子からのタンパク質合成量と翻訳調節を生細胞で測定することを可能にし、GFPに融合させた単鎖可変断片（scFv）とペプチドエピトープのタンデムリピートとの相互作用によって機能します。このシステムにより、単一mRNAの解像度で翻訳と局在の動的な測定が可能となり、そのため数多くの新生鎖追跡システムが開発されてきました^15,16。しかし、このアプローチはスループットが低く、高出力の顕微鏡を使用する必要があります。

新生タンパク質へのタグ付けは避けられませんが、生細胞内でのmRNA翻訳を報告するために、NanoLucルシフェラーゼ由来の小さなペプチドタグを利用する可能性が示されています。NanoLucルシフェラーゼは、小さな11アミノ酸のサブユニット（HiBiT）と、より大きな158アミノ酸のサブユニット（LgBiT）に分割されるよう設計されており、これらは迅速に二量体化し、基質の存在下で機能的なルシフェラーゼを再構成することができます^17,18。mRNAダイナミクスの研究において、この分割発光タグシステムにはいくつかの重要な利点があります。第一に、POIに融合させる小サブユニットのサイズが最小限であるため、コードされた構築物を目的の天然タンパク質に可能な限り近づけることができます。コード配列の長さは翻訳効率に直接影響を及ぼす可能性があるため¹⁹、タグの長さを最小限に抑えることで、合成mRNAの翻訳ダイナミクスの予測精度を高めることができます。極めて重要な点として、この最小限のタグ付け戦略により、同義コード配列のバリエーションによって駆動される翻訳の差異を検出することが可能になり、タンパク質の配列や安定性とは独立して翻訳効率を調査することができます³。このため、蛍光タンパク質やフルレングスのルシフェラーゼのような大きなタグの使用は最適ではありません。第二に、ここで採用した分割発光タグシステムは、即時の信号生成を可能にします。その迅速かつ効率的なin cellulo相補反応は、高い親和性（K_D = 700 pM）が報告されており、30 sという短い間隔での読み取りによるタンパク質ターンオーバーの調節測定に使用されています¹⁸。元の分割発光タグシステムは主に他の分割ルシフェラーゼシステムとの比較でベンチマークされていましたが^17,18、この文脈における最大の利点は、信号生成がタンパク質の成熟によって制限されないことです。対照的に、蛍光タンパク質は発色団の成熟に数分から数時間を要するため²⁰、時間分解能が制限されます。最後に、ここで採用した確立済みの分割発光タグシステムは、相補後に発色団の形成を通常必要とする分割蛍光タンパク質システムの制限を克服しており²¹、これにより追加の遅延が導入され、迅速で動的なプロセスの捕捉への適応性が制限されるという問題を解消しています。先行研究では、タンパク質ターンオーバーアッセイや分解研究における分割発光タグの有用性が実証されています^22,23,24。この確立された技術を翻訳キネティクスに拡張することは、重要な手法上の進歩を意味します。例えば、リボソームプロファイリングは転写産物上のリボソーム密度を明らかにできますが、異なる条件下での翻訳開始率や伸長率の動的な変化を容易に捉えることはできません。既報の通り³、この分割発光タグシステムは、キャップ構造、5′非翻訳領域（UTR）の組成、コドン最適化、ヌクレオチド修飾、およびpoly(A)テイルの長さなどの変更による差異を検出でき、これらはすべて翻訳効率の重要な決定因子です。この適用範囲の広さにより、個々のmRNAの特徴がタンパク質の総出力にどのように寄与しているかを解明する上で、本手法は非常に強力なものとなります。なお、使用する機器によって、単一細胞およびウェル全体のデータの両方をこの技術で取得できることは注目に値します。発光ベースの画像を取得できるイメージングプラットフォームを利用すれば、この技術を用いて単一細胞の翻訳ダイナミクスを研究することが可能です。ここでは、中〜高スループットであることおよびデータ分析への要求が最小限であることから、プレートリーダーを用いたウェルベースのアプリケーションに焦点を当てます。

この手法の検討にあたり、研究者は自身の具体的な実験目的に照らして、その妥当性を評価する必要があります。本アッセイは、mRNAベースの治療薬設計パイプラインなど、合成mRNA構築物のハイスループットスクリーニングが必要な状況において特に有用です。また、非翻訳領域、コドン使用頻度、あるいはヌクレオチド修飾を含む合成mRNAの配列特性の比較分析に適しており、翻訳効率のわずかな差を検出することが可能です³。本システムは、無細胞翻訳プラットフォーム、生細胞アッセイ、および時点特異的な溶解アッセイとの互換性があるため、メカニズム研究または応用研究のいずれかに合わせて実験設計を調整したい研究者に柔軟な選択肢を提供します。同時に、本手法の限界を認識しておくことも重要です。決定的な点として、スプリットルミネッセンスタグgingアッセイでは、リボソームフットプリンティング法のみが持つ能力であるリボソーム占有率の解像度は得られません。また、RNAの安定性や分解を直接測定することはできず、これらは補完的な手法を用いて評価する必要があります。しかしながら、既存のリボソーム中心的な手法には限界があるため、翻訳ダイナミクスの代用指標として、時間分能を持つmRNA駆動のタンパク質発現を調査するには、スプリットルミネッセンスシステムのようなタグベースのアッセイに依存することになります。したがって、本システムは合成mRNA駆動のタンパク質発現をモニタリングするための強力なツールとなりますが、その適切性は、研究課題が詳細なリボソームの位置指定やRNA分解ではなく、動的なタンパク質出力に焦点を当てているかどうかに依存します。

要約すると、分割ルミネッセンスタグ標識システムは、mRNA翻訳の研究における強力かつ多用途な手法です。その全体的な目的は、構造的および配列的要素が異なる合成mRNAから生じるタンパク質出力の差異を検出可能で、柔軟かつシステム的に拡張可能なハイスループットな手段を研究者に提供することにあります³。本システムの開発根拠は、既存技術の限界を克服し、感度、スケーラビリティ、および時間分解能における利点を提供することにあります。RNA生物学および治療法の広範な文献において、本手法は実験的レパートリーへの貴重な追加となり、基礎的な知見とトランスレーショナルな進展の両方を可能にします。このアッセイの強みと限界を慎重に検討することで、研究者は自身の特定のアプリケーションへの適切性を判断でき、それによって急速に進化するRNA科学の分野においてその影響を最大化することができます。

プロトコル

プロトコル全体の概略図を図1に示します。

1. 〜のためのテンプレート調製 in vitro 転写（IVT）

注：IVT用のDNAテンプレートを調製する際は、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼプロモーター（一般的にT7またはSP6）、5'および3' UTR、および目的タンパク質（POI）のオープンリーディングフレームが含まれていることを確認してください（図1）。

1. 3' UTRの後に単一の切断部位を持つ制限酵素を用いてプラスミドDNAを直線化し、製造元の指示に従って反応系を調製する。インキュベーション後、スピンカラム方式のDNA精製キットを用いて制限酵素消化反応液を精製する。分光光度計を用いてDNA量を定量する。
2. 直線化を確認するため、0.1 µg/mLのエチジウムブロマイドDNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲルを調製する。消化したDNA 150 ngを水およびローディングダイと混合する。アガロースゲルにサンプル、未切断プラスミド、およびDNAラダーをロードし、1×Tris-酢酸-EDTA (TAE) バッファー中で100 Vで40分間電気泳動を行う。ゲルイメージャーで可視化する。
   注意：エチジウムブロマイド溶液は強力な変異原であるため、適切な個人用保護具（PPE）を用いて慎重に取り扱う必要がある。
3. プラスミドDNAの3' UTRの直後にポリ(A)テールがない場合は、PCRを用いて導入する。適切に設計されたプライマーとハイフィデリティポリメラーゼを用い、製造元の指示に従ってPCRを行う。アンプリコンにT7プロモーター、オープンリーディングフレーム、およびポリ(A)テールが含まれていることを確認する。
   注：キャッピング技術によってはT7プロモーターに特定の配列要件がある場合がある。そのため、適切なフォワードプライマーの設計によってこれらの要件を満たすことができる。リバースプライマーは3' UTRの末端に結合し、ポリ(A)テールを導入する（推奨される長さは少なくとも80 T）。GC含量の高いコンストラクトについては、ステップアップPCRおよび/または3% DMSOの使用を推奨する。
4. PCRの成功を確認するため、エチジウムブロマイドを含むアガロースTAEゲルを調製する（ステップ1.2を参照）。コンストラクトの長さが≥1 kbの場合は1%ゲルを、<1 kbの場合は2%ゲルをそれぞれ調製する。PCR反応液5 µLを水およびローディングダイと混合する。アガロースゲルにサンプルとDNAラダーの両方をロードし、TAEバッファー中で100 Vで40分間電気泳動を行う。ゲルイメージャーで可視化する。
5. PCRによるサイズ確認後、スピンカラム方式のDNA精製キットを用いてPCR反応液を精製する。IVTに使用するためのDNAテンプレートを濃縮するため、15–20 µLの溶出バッファー（通常はDNA精製キットに付属）またはヌクレアーゼフリー水で溶出する。分光光度計を用いてDNA量を定量する。

2. In vitro転写

1. 開始前に、ベンチ、手袋、およびピペットをRNase除染液でスプレーし、拭き上げます。収量と品質を向上させるため、この手順は滅菌フード環境下で実施してください。
2. 製造元の指示に従い、T7ベースのin vitro転写（IVT）キットの構成成分を融解し、調製します。
   注：一部の製造元では、反応の酸化を抑え効率を向上させるためにジチオスレイトール（DTT, 0.1 M）の使用を推奨しています。キットと互換性がある場合は、このステップを推奨します。修飾dNTPを使用する場合は、対応する未修飾ヌクレオチドを同量の修飾ヌクレオチドに置き換えてください。全量反応では収量に大幅な改善が見られなかったため、半分量での反応で収量を評価してください。複数のmRNAを合成する場合は、ピペッティングエラーとばらつきを減らすためにマスターミックスを作成することをお勧めします。
3. ピペットで十分に、かつ短時間混ぜ合わせ、結露を防ぐために加熱蓋を使用して37 °Cで5時間インキュベートします。必要に応じてインキュベーションをオーバーナイトまで延長してください。これによりmRNAの収量や完全性に与える影響は最小限です。
4. DNase Iを1 µL加え、ピペットで十分に混ぜます。37 °Cで30分間インキュベートします。
5. in vitro転写（IVT）RNAの精製
   1. 製造元の指示に従い、カラムベースのRNAクリーンアップキットを用いてIVT反応液を精製します（キットによって回収率や結合容量が異なる場合があります）。溶出には、ヌクレアーゼフリー水を60 µL加え、室温で5分間インキュベートした後に遠心分離します。
   2. あるいは、より安価で柔軟な方法として塩化リチウム沈殿法を使用します。
      1. 反応液に等量の7.5 M塩化リチウムを加え、混ぜて-20 °Cでオーバーナイトインキュベートします。
      2. 4 °C、18,300 × gで20分間遠心分離し、RNAペレットを乱さないように注意して上清を取り除きます。
      3. 70%エタノール950 µLで洗浄し、4 °C、18,300 × gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを室温で約5分間乾燥させた後、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁します（標準は60 µLですが、濃度を高めるにはペレットの大きさに応じて液量を減らしてください）。
         注意：適切なPPE（個人用保護具）を使用しない場合、塩化リチウムは皮膚や目に刺激を与える可能性があります。取り扱う際は手袋と保護メガネを着用してください。また、エタノールは引火性の高い液体であり、目に刺激を与える可能性があります。裸火から遠ざけ、保護メガネを含む適切なPPEを着用してください。
6. 分光光度計を用いてmRNAを定量します。mRNAのA260/A280比が約2.0であることを確認し、A260/A230比が1.8から2.2の間にあることを確認してください。
7. IVTの成功を確認するために、エチジウムブロマイドを含む1%アガロースTAE（非変性）ゲルを調製します。500 ngのmRNAを水およびローディングダイと混ぜ、RNAラダーの調製および変性手順に関する製造元の指示に従います。アガロースゲルにアプライし、TAEバッファー中で80 Vで40分間電気泳動します。ゲルイメージャーで可視化します。
8. mRNAの正しいサイズをさらに確認するには、サンプルをBioanalyserで解析します。
9. 凍結融解を避けるため、実験に必要な量ずつmRNAを分注します。例えば、96ウェルプレートの1ウェルあたり1.2 pmolのmRNAを使用する場合、1.2 pmol × n回繰り返し分に相当する適切な量を分注し、-80 °Cで保存します。

3. HEK293のリバーストランスフェクション

注：時間的な測定を行うには、相補的なルシフェラーゼ断片を恒常的に発現している細胞株が必要です。これは、必要なルシフェラーゼ断片を発現するプラスミドをトランスフェクションし、その後のクローン選択を行うことで、安定細胞株を作成することで達成できます。これにより、任意の細胞背景において、時間分解能を持ったmRNA翻訳ダイナミクスの測定が可能になります。あるいは、必要なルシフェラーゼ断片を発現している細胞株を購入することも可能です。本実験では、相補的なヘテロ二量体を恒常的に発現しているHEK293細胞を用いて実施しました。

1. 開始前に、分解を防ぐためmRNAを氷上で解凍する。
2. トランスフェクション複合物を調製する。96ウェルプレートの場合、1ウェルあたり1.2 pmolのmRNAが必要である。デュプリケートで実施する場合、ピペッティング誤差を考慮して2.5倍量分を調製する。したがって、3 pmolのmRNAをOpti-MEM Reduced Serum Mediumに加え、最終容量を50 µL（20 µL/ウェル）にする。
3. カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を0.5 µL（0.2 µL/ウェル）加え、ピペッティングで混ぜて室温でインキュベートする。5分間インキュベートした後、ピペッティングで混ぜ、96ウェル白色平底マイクロプレートに1ウェルあたり20 µLずつ加える。トランスフェクションを行うウェルはプレートの中央に配置し、外周のウェルは空けておくことが推奨される。
4. HEK293細胞を調製するため、培地を除去し、Ca²⁺およびMg²⁺不含のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mLで洗浄する。洗浄液を除去し、Trypsin-EDTAを500 µL加え、37 °Cで3分間インキュベートする。
5. 細胞解離の間、細胞培養中の培地の蒸発を抑えるため、96ウェルプレートの外周ウェルにPBSを満たす。すべてのウェルを使用する場合は、ウェルの間にPBSを満たすことができる。
6. 1× L-glutamineおよび10%胎児牛血清（FBS）を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）を4.5 mL加え、細胞を回収する。ヘモサイトメーターまたは自動細胞計数器を用いて細胞数を計測する。
7. 必要な量の細胞（1ウェルあたり1 x 10⁵ cellsを播種するのに十分な量に、ピペッティング誤差用の3ウェル分を加えた量）を新しいチューブに移し、500 × gで2分間遠心分離する。
8. 上清を除去し、10% FBSおよびEndurazine Live Cell Substrate（1:200）を添加したLeibovitz’s L-15 medium（フェノールフリー）の必要量で再懸濁し、最終濃度を1 × 10⁶ cells/mLにする。Endurazineが十分に混ざるように、セロロジカルピペットで混合する。再懸濁した細胞を1ウェルあたり100 µL（1 × 10⁵ cells）ずつ分注する。
   注：72時間のタイムコース実験を行う場合は、蒸発を防ぐために液量を200 µLに増やす。
9. トランスフェクション直後、細胞を37 °Cに設定したプレートリーダー（ルミノメーター）に設置する。積分時間を1 sとして、一定の間隔で記録を行う。システムの相補効率が高いため、数分以内にシグナルが検出される。したがって、正確なベースライン値を測定するためには、この手順を速やかに実行する必要がある。測定間隔は実験や装置に依存するが、本実験では18時間のタイムコース実験では12分ごと、72時間の実験では48分ごとの測定が最適であった。ルミネッセンスの測定にフィルターは不要だが、530–540 nmのフィルターを使用した場合に、より良好なS/N比が観察された。
   注：Bioluminescence Resonance Energy Transfer（BRET）シグナルは、スプリットルシフェラーゼタグ付きeGFPから生成されるため、530–540 nmのフィルターではルミネッセンスシグナルと蛍光シグナルの両方が検出される。BRETの検出を避けるには、460–480 nmのフィルターを使用するか、あるいはMYL3などの非蛍光タンパク質をリファレンスとして使用する。

4. データ解析

1. アッセイ開始時のシグナルがバックグラウンドレベルとなるため、各条件のシグナルを最初のタイムポイント（t0、テクニカルリプリケートの平均に正規化）で正規化し、相対ルミネッセンスユニット（RLU）のフォールドチェンジを算出します。
2. コントロール条件で正規化することにより、バイオロジカルリプリケート間のばらつきを低減させます。
3. 解析の目的に応じて、単一タイムポイントまたは曲線下面積（AUC）のいずれかの統計解析を選択します。
   1. 単一タイムポイントの場合、ピーク発現が起こるタイムポイント（POIに依存する）とエンドポイントのタイムポイントを使用します。ステップ4.1で算出した特定のタイムポイント（例：240 min）におけるRLUをプロットし、適切な統計検定を用いて解析します。
   2. 特定の時間枠（t0から240 minまで）またはアッセイ全期間（t0からエンドポイントまで）のAUCを算出することで、タンパク質の翻訳および分解のダイナミクスを測定します。各バイオロジカルリプリケートのAUC値をリファレンスmRNAの平均で正規化し、これにより得られたAUCのフォールドチェンジを適切な統計検定を用いて解析します。

結果

本プロトコルの費用対効果を最適化する方法はいくつかあります。例えば、IVT反応をメーカー推奨量の半分の量にスケールダウンしましたが、その結果得られた収量は、以下に必要とされる量を満たしていることが分かりました。 in cellulo 実験。配列の長さと複雑さがIVT収量に影響を与えるため、プロトコルの最適化に成功した場合には、1回のIVT反応あたり少なくとも50 µgのmRNAが得られるべきであることに留意されたい。IVT反応キットと同様に、キャッピング試薬も高価であることが多い。mRNA分子1つにつき1つのキャップのみが必要であることを考慮し、IVT反応には得られるmRNA分子数に対して過剰な量のキャップ分子が含まれているという仮説を立てた。そこで、IVT反応に添加するキャッピング試薬の量を滴定することで、プロトコルをさらに最適化できるかどうかを検討し、その結果を以下に示す。 図2100%（最終濃度 10 mM cap）、50%、25%、または0%（キャップなし）のキャッピング試薬を10 µLのIVT反応系に添加し、得られたeGFP mRNAを、相補的なヘテロ二量体を恒常的に発現しているHEK293細胞にトランスフェクションした。標準化コントロールとして、MYL3（100%キャップ済み）も同様にトランスフェクションした。この内在性遺伝子は筋肉に特異的な構造タンパク質をコードしており、eGFPと同様の翻訳ダイナミクスを示すが、シグナル強度は他の内在性遺伝子に近い。³既往のデータと一致しており³キャップ構造のないeGFP mRNAでは、模擬コントロール（mock control）と同様に翻訳が起こらなかった（図2A）。推奨量の25%または50%のキャッピング試薬を用いて合成したeGFP mRNAは、100%の場合と同等の発現レベルを示した（図2A）、その結果、18時間のタイムコースにおいて曲線下面積（AUC）値に差は認められなかった（図2B）。これらの結果は、これらの条件下においてキャッピング試薬が過剰に存在しており、その濃度を下げても翻訳効率を損なわないことを示しており、これは十分なキャップ導入が行われていることと一致しています。以下に示す知見では、 図2 使用するキャッピング試薬のブランドによって異なり、異なる試薬に対しては最適化を行う必要があります。

キャップ技術の進歩と修飾ヌクレオチドの導入によりmRNA発現は強化されましたが、mRNA設計アルゴリズムの開発により、発現はさらに向上しました。これらのアルゴリズムは、それぞれ最小自由エネルギー（MFE）とコドン適応指数（CAI）を改善することで、mRNAの安定性とコドン使用率の最適化に焦点を当てています。最適化がmRNA発現に及ぼす影響を検証するため、LinearDesign⁹を利用しました。このアルゴリズムはラムダ値の入力に基づいており、これは最適化式で使用されるスケーリングパラメータで、アルゴリズムがMFEとCAIのどちらをどの程度重視するかを決定します。4つの転写因子（HAND2、GATA4、MEF2C、TBX5）に対し、同一の最適化設定（すなわち、同一のラムダ値）を適用しました。図3では、最適化が翻訳速度に及ぼす影響を調査しています。最適化により、すべての転写因子においてMFEとCAIの両方の値が改善し、特にMEF2Cにおいて両パラメータの最大の変化が認められました（図3A）。各構築物のC末端に、GSリンカーを介して分割ルミネッセンスタグを融合させ、4つの転写因子すべてについて、非最適化形式と最適化形式の両方のmRNAを合成しました。各mRNAが翻訳可能であり、期待される分子量のタンパク質が産生されることを確認するため、ウサギ網状赤血球ライセート無細胞翻訳系³を用いました。得られたタンパク質は、分割ルシフェラーゼタンパク質の酵素サブユニットと適切な基質を用いて分割ルミネッセンスタグを検出するウェスタンブロット法により分離しました。ウェスタンブロッティングの結果、最適化後もタンパク質は期待される分子量と一致していることが示されました（図3B）。HEK293細胞に各転写因子の非最適化形式または最適化形式をトランスフェクションし、18時間にわたって生細胞記録を行いました。すべての18時間実験において、3つの生物学的レプリケートから測定を行い、各反復実験につきサンプルあたり3つのテクニカルレプリケートを用いました。HAND2（図3C）およびGATA4（図3D）の最適化は、発現に影響を与えず（対応のない2標本t検定により判定）、非最適化形式と比較してそれぞれ1.07倍の増加および1.25倍の減少となりました。一方、MEF2C（図3E）およびTBX5（図3F）の最適化は、統計的に有意な発現量増加をもたらし、それぞれの非最適化バージョンに対してAUCが2.25倍（P = 0.0486, n = 3, 対応のない2標本t検定）および1.72倍（P = 0.0379, n = 3, 対応のない2標本t検定）上昇しました。これと一致して、エンドポイントでの発現だけでなく、発現曲線の形状と速度においても差が観察され、このアッセイが時間経過に伴う翻訳ダイナミクスの変化を分解能を持って検出できることが示されました。この発現増加がより長期間維持されるかを確認するため、HEK293細胞にMEF2C mRNAをトランスフェクションし、72時間にわたって記録を行いました（図3G）。18時間の実験と同様に、3つの生物学的レプリケートから測定を行い、各反復実験につきサンプルあたり3つのテクニカルレプリケートを用いました。18時間後に観察された結果と同様に、最適化されたMEF2Cは発現を有意に増加させ、非最適化バージョンと比較してAUCが2.5倍（P = 0.0061, n = 3, 対応のない2標本t検定）改善しました。最適化によって発現量は大幅に増加しましたが、今回の結果では、最適化が72時間にわたる分解を防止するわけではないことが示され、両方のMEF2C形式は24時間以降に同様の勾配を示しました。この分解は、線形的なmRNA分解および/または細胞分裂に起因するものと考えられます。以上の結果から、mRNA設計アルゴリズムがmRNA発現を向上させる可能性が示されましたが、同時に、最適化はPOI依存的に行われる必要があることが浮き彫りになりました。

図 1: HEK293細胞におけるmRNA合成およびスプリット発光タグアッセイのワークフロー。 スプリット発光タグアッセイのためのIVTを行うには、プラスミドにRNAポリメラーゼプロモーター（T7またはSP6）、5'および3' UTR、ならびに短いルシフェラーゼサブユニットHB (HiBiT) に融合した目的タンパク質のコーディング配列が含まれていることを確認してください。プラスミドを単一サイト切断制限酵素で線状化し、Poly T PCRのテンプレートとし、それをさらにIVTのテンプレートとして使用します。合成したmRNAをリポソームと複合体化させ、大きなルシフェラーゼサブユニット（LB）を構成的に発現しているHEK293細胞へ逆トランスフェクションし、直ちにプレートリーダーに設置してライブレコーディングを測定します。実験終了後、標準化およびその後の統計解析のためにデータ解析を行います。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 2: キャップ試薬の濃度を4分の1に減少させても、全濃度と同等のeGFP発現が得られる。(A>) 様々な濃度のキャップ試薬、MYL3、またはMockを用いてeGFP mRNAを導入したHEK293細胞におけるライブセル・キネティックアッセイ。データはt₀で正規化しており、各点は各時点における少なくとも3つの生物学的反復の平均を示す。(B>) 少なくとも3つの生物学的反復による18時間のタイムコース曲線のAUCにおける倍率変化。リファレンスサンプルであるMYL3で正規化し、Tukeyの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）により比較した。データは平均値 ± 平均標準誤差（SEM）として示し、各点は生物学的反復の平均値を表す。***P < 0.001。(eGFP – 拡張緑色蛍光タンパク質; AUC – 曲線下面積; RLU – 相対発光単位) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: 配列の最適化により、POI依存的にmRNA翻訳が向上する。(A) LinearDesignによるmRNA配列の最適化により、各転写因子の最小自由エネルギー（MFE）の低下およびコドン適応指数（CAI）の値の上昇が認められた。(B) 非最適化または最適化されたHAND2, GATA4, MEF2C, TBX5をコードするmRNA、またはRNAなしを用いて、RRL反応を120分間行った。得られたタンパク質をウェスタンブロッティングに供し、メンブレンをスプリットルシフェラーゼシステムの酵素サブユニットおよび適切な基質でインキュベートし、化学発光により検出した。非最適化または最適化されたHAND2 (C)、GATA4 (D)、MEF2C (E)、またはTBX5 (F)を、MYL3およびMockと共にHEK293細胞にトランスフェクションした際の生細胞キネティックアッセイ。データはt₀で標準化し、点は各タイムポイントにおける3つの生物学的反復の平均を示す。3つの生物学的反復における18時間のタイムコースの曲線のAUCの倍率変化は、参照サンプルであるMYL3で標準化して算出し、Welchの補正を用いた非ペアt検定で比較した。データは平均 ± SEMで示し、各点は生物学的反復の平均を表す。*P < 0.05。(G) 非最適化または最適化されたMEF2C, MYL3, およびMockをトランスフェクションしたHEK293細胞における生細胞キネティックアッセイ。データはt₀で標準化し、点は各タイムポイントにおける3つの生物学的反復の平均を示す。3つの生物学的反復における72時間のタイムコースの曲線のAUCの倍率変化は、参照サンプルであるMYL3で標準化して算出し、Welchの補正を用いた非ペアt検定で比較した。データは平均 ± SEMで示し、各点は生物学的反復の平均を表す。**P < 0.01。(MFE – 最小自由エネルギー；CAI – コドン適応指数；RRL – ウサギ網状赤血球ライセート；AUC – 曲線下面積, RLU – 相対発光単位) ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

mRNA治療薬の分野は近年急速に拡大しており、開発パイプラインにおける極めて重要な段階として、配列設計と最適化の重要性が強調されています。最も効果的なRNA構造と組成を予測するための計算ツールの構築に多大な努力が注がれており、特に配列の最適化が注目されています^8,9。これらのツールは強力ですが、これらの設計を実験的に検証することは、依然としてパイプラインの不可欠な一部です。しかし、この検証は主に、GFP⁷、NanoLuc⁸、SARS-CoV-2スパイクタンパク質⁹ などの、すでに極めて安定し、翻訳効率の高いレポータータンパク質に依存してきました。この制限を克服するため、HEK293細胞におけるin vitro 転写mRNAの翻訳ダイナミクスを研究するパイプラインに分割ルシフェラーゼシステムが導入され、時間分解能が可能となり³、mRNAエンジニアリングによる翻訳の変化を検出する際にレポータータンパク質を使用することの限界が示されました。本メソッドの記事では、このアッセイの実行に必要な手順を実演し、IVT反応の小型化および5’キャップ濃度の低減が可能であり、それによって翻訳への影響を及ぼすことなくコストを削減できることを示します。これまでの知見に基づき、発現量を増加させるには、POIに依存したmRNA配列最適化アプローチが必要であることを強調します。

ここで述べたように、分割ルミネッセンスタグアッセイは、mRNA翻訳の中スループット測定を可能にする比較的シンプルなパイプラインであり、目的タンパク質（POI）の経時的な発現をリアルタイムで調査することができます。しかし、堅牢な結果を得るためには、いくつかの重要なステップと考慮事項があります。第一に、すべてのダウンストリームの結果はmRNAの品質に依存しており、それはIVTおよび使用する器具の除染から始まります。合成後、mRNAの保存が極めて重要であり、溶出後は氷上で保持し、mRNAのサイズを確認した後、凍結融解を防ぐために分注して-80°Cで保存します。第二に、使用する96ウェルプレートが非常に重要であり、実験間で一貫性を持たせる必要があります。本プロトコルでは、必ず全面白色の96ウェルプレートを使用してください。細胞形態のモニタリングが必要な場合は、底面透明・壁面白色のプレートを使用できますが、これらは信号強度が大幅に低下するため、2種類のプレートを互換的に使用することはできません。同一のmRNAの翻訳を底面透明・壁面白色プレートで測定したところ、得られたルミネッセンス信号は、並行して用いた全面白色プレートよりも5倍低かったことが観察されました。この技術的な留意点は、翻訳ダイナミクスが非効率な遺伝子を評価する際に影響を及ぼす可能性があります。データの不整合を招くだけでなく、信号の減少によって、mRNAの配列や構造的な摂動によって誘導されるわずかな差の検出ができなくなる可能性があります。第三に、L-15培地の使用が本アッセイの鍵となります。これにより、CO₂の補充がない環境でも細胞の生存が可能となり²⁵、使用するルミノメーターの選択肢が広がります。さらに、フェノールフリーのL-15を使用することで、ルミネッセンス測定時のバックグラウンド信号を低減できます。最後に、37°C（または目的の細胞種の培養条件）で培養およびルミネッセンス測定を行うことです。この実験を室温で実施すると、翻訳伸長速度が低下するため²⁶、正常なキネティクスが観察されなくなり、結果が大きく変わってしまいます。

in vitro転写mRNA設計の汎用性は合成プロセスにも適用でき、数多くの修飾が可能です。観察されたように、5'キャップの濃度を4分の1に低減しても同等の発現を達成でき、研究者はコストを削減することが可能です。IVT後のキャップ効率は直接測定していませんが、IVTプール内の非キャップmRNAの割合が増加すれば、非キャップmRNAで実証されたようにシグナルの低下を招きますが、そのような現象は観察されませんでした。さらに、eGFPはわずか27 kDaという比較的小さなタンパク質であるため、このキャップ濃度の調整は、IVT後にキャップを付加すべき転写産物がより少なくなるため、より大きな遺伝子においても容易に適用できるはずです。異なるメチル化修飾を持つ複数のキャップアナログが存在し、これらは免疫原性³やタンパク質発現²⁷に影響を与えます。加えて、キャップ付加プロセスは、共転写的に（本手法で実証）行うか、あるいはワクシニアウイルスを用いて転写後に行うことができ、後者は100%のキャップ効率²⁸を実現しますが、追加の精製ステップが必要となります。ラボスケールのmRNA製造では、迅速かつ効率的な精製カラムが一般的に使用されますが、コストが高くなります。より安価で汎用性の高いアプローチは塩化リチウム沈殿法であり、時間はかかりますが、mRNAを濃縮でき、収量がカラムの結合容量に制限されないため、スケールアップに適しています。精製カラムと同様に、この手法では二本鎖RNAや切断されたRNA断片を完全に除去することはできず、これらが免疫原性を引き起こします²⁹。5'キャップと同様に、poly(A)テールの導入も、ここで説明した方法以外に代替的な方法で達成できます。PCRによるテールの導入と同様に、プラスミドDNAを設計してpoly(A)テールを含ませることが可能ですが、これらの長い領域は組換えを起こしやすく、その結果、不均一で短縮されたpoly(A)配列が生じることがあります。しかし、poly(A)セグメンテーション（異核酸スペーサーの挿入）により、これらの影響は最小限に抑えられています^30,31。あるいは、テンプレート非依存的なpoly(A)ポリメラーゼを用いてpoly(A)テールを生成することもでき、より長いpoly(A)テールの生成が可能になりますが³²、不均一性が規制要件に影響を及ぼすリスクがあります³³。

上述の分割ルミネッセンスタグアッセイは、外来的に導入されたmRNAのタンパク質発現を測定するのに非常に有効ですが、研究目的によっては考慮すべきいくつかの限界があります。第一に、分割ルシフェラーゼの半分を構成的に発現する細胞株を作成する必要があります。これは既製品として購入可能ですが、現在はHEK293細胞のみに限定されています。目的の細胞型で安定株の作成が困難な場合は、溶解アッセイが存在し、我々はこれがHEK293、ヒト胚性幹細胞、および分化した心筋細胞の間で同様の結果を示すことを確認しています³。ただし、この既報の研究³で溶解アッセイに選択されたタイムポイントは、生細胞HEK293のデータに基づいて決定されました。第二に、本アッセイは生細胞での時間分解能を提供しますが、一部の研究者が関心を持つ可能性のある生細胞での空間分解能は提供できません。しかし、本実験で使用した短いルシフェラーゼペプチドタグに対して、蛍光免疫細胞化学染色で良好に機能する一次抗体が存在するため、翻訳されたPOIの空間的な解析が可能です。さらに、ルミネッセンスイメージングが可能な顕微鏡を使用すれば、単一細胞レベルの分解能データを得ることができます。時空間情報を提供するアプローチとしてはSunTagがあり、これはGFPタグ付きscFvとペプチドエピトープとの相互作用を介した生細胞イメージングを用いて、活性な翻訳と局在を測定します^14,34。しかし、これらのエピトープの24回タンデムリピートが必要であり、それによって翻訳が歪められる可能性があり、またワークフローのスループットが比較的低いという課題があります。第三に、分割ルミネッセンスタグはmRNA量を測定することを可能にしますが、生細胞内では不可能です。我々の以前の研究³では、外来的に導入された転写産物特異的なプライマーを用いて、抽出したRNAに対してqRT-PCRを行い、構築物間の導入効率およびタイムポイント間の分解によるmRNAレベルを確認しました。別の手法として、mRNAの安定性を測定するためにノーザンブロッティングが用いられています³⁵。しかし、どちらのアプローチも手間がかかり、連続的な測定を行うことはできません。現在、生細胞内でmRNAの翻訳と量を同時に測定できる手法は存在せず、この分野におけるアッセイ開発を前進させるための潜在的な道が残されています。

分割ルシフェラーゼシステムは、当初はタンパク質のダイナミクスの研究に適用されましたが、このアッセイが他の研究領域においても大きな意義を持つことは明白です。mRNA治療薬が新しい遺伝子治療アプローチの最前線にある現在、このアッセイは研究者が潜在的な治療薬の発現を特性評価し、発現を強化するために最適化するのに最適です。前述の通り、複数のツールの開発により、コドン最適化はmRNA設計における強力な新しいツールとなっています^8,9,36。一様な配列最適化アプローチを4つの転写因子に適用したところ、すべての遺伝子でMFEとCAIの両方が改善されましたが、発現の増加を示したのはMEF2CとTBX5のみでした。特筆すべきは、同義のコーディング配列の変異のみから生じる発現の差を検出可能にすることで、このアプローチが、高い時間分解能で生細胞内の翻訳効率を調査するためのユニークなプラットフォームを提供することです。これらの知見は、発現を強化するためには、POI（目的タンパク質）依存的な方法で、開始時のGC含有量、コドン使用頻度、およびRNA二次構造を考慮して配列最適化を行う必要があることを示しています。より多くの構築物をテストする必要があるかもしれませんが、分割ルミネッセンスタグアッセイは、POIにとって最適な候補を特定するためのハイスループット分析の可能性を秘めています。さらに、既報³のとおり、このアッセイはmRNAの任意の配列または構造要素を摂動させた際の影響を測定でき、その応用範囲をさらに広げています。mRNAの改変の調査以外にも、分割ルミネッセンスタグアッセイはデリバリーおよび製剤研究に利用可能です。5'キャップの改善や修飾ヌクレオチドの使用があっても、外因的に導入されるmRNAは、分解を防ぎ細胞に取り込ませるためのパッケージングシステムを必要とします³⁷。脂質ナノ粒子³⁸、細胞外小胞³⁹、およびバイオミメティクス⁴⁰がmRNAデリバリーの最前線にありますが、さらなる開発が依然として必要です。これらのキャリアのいずれかに分割ルミネッセンスタグ付きmRNAを封入することで、そのデリバリー効率の特性評価が可能となり、研究者は修飾されたキャリアを中〜高スループットでテストすることができます。翻訳に焦点を当てた研究以外でも、分割ルミネッセンスタグアッセイは基礎生物学に容易に利用可能です。mRNA翻訳に対する配列および構造要素の摂動の影響の評価、翻訳装置の機能への干渉、あるいはプロテアソームの探索など、分割ルミネッセンスタグシステムは魅力的な選択肢を提供します。

総じて、本稿で述べた分割ルミネッセンスタグシステムは、翻訳ダイナミクスの読み出しとして、合成mRNA駆動のタンパク質発現を時間的にモニタリングするための柔軟で堅牢なアッセイを提供します。生細胞アッセイを実装することで、mRNA翻訳分野における従来の多くの制限を克服し、タンパク質合成とPOI分解のダイナミクスに関する重要な情報を明らかにできます。転写産物によって制御および発現プロファイルが異なるため、治療用POIを特性評価することが不可欠であり、それによってmRNA治療薬のさらなる進化と臨床への応用が可能になります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸	Sigma-Aldrich	A6283	TAE緩衝液の成分
アガロース	Sigma-Aldrich	A9539	ゲル電気泳動用
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	mRNAの品質管理に使用するバイオアナライザー
CLARIOstar Plus ルミノメーター	BMG Labtech	430-501S-F	発光測定に使用するプレートリーダー/ルミノメーター
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	IVTに使用する5'キャップ
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966029	HEK293-LgBiT細胞の培養に使用する培地
DNase I	New England Biolabs	M0303	IVT反応後のDNAテンプレートを分解
ダルベッコPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Sigma-Aldrich	D8537	細胞洗浄および蒸発防止のためのプレートへの添加用
EDTA, pH 8.0, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9260	TAE緩衝液の成分
エチジウムブロマイド	Sigma-Aldrich	E1510	ゲル電気泳動用の染色剤
胎児ウシ血清 (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	DMEMに添加するサプリメント
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040	in vitro 転写 (IVT) キット
Leibovitz L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	発光測定中のHEK293-LgBiT培養に使用する培地
L-グルタミン	Thermo Fisher Scientific	25030-024	DMEMに添加するサプリメント
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	脂質ベースのトランスフェクション試薬
塩化リチウム沈殿溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9480	IVT後のmRNA精製における代替手法
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1130	プラスミド直鎖化後の精製キット
NanoDrop One マイクロボリューム UV-Vis 分光光度計	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	DNAおよびmRNA濃度の定量に使用する分光光度計
Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate	Promega	N2570	L-15培地に添加する発光に必要な基質
NucleoSpin RNA Cleanup Kit	Macherey-Nagel	12708612	IVT反応後のmRNAを精製
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Fisher Scientific	136101	HEK293-LgBiTの播種およびその後の測定に使用するプレート
Opti-MEM 低血清培地	Thermo Fisher Scientific	31985062	トランスフェクション反応に使用する培地
Phusion High-Fidelity PCR Kit	New England Biolabs	E0553	PCRキット
RiboRuler High Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	11883993	ゲル電気泳動用のRNAラダー
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	RNase除染スプレー
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	TAE緩衝液の成分
トリプシン-EDTA溶液	Sigma-Aldrich	T4174	細胞解離試薬
UltraPure DNase/RNase free 蒸留水	Thermo Fisher Scientific	10977035	テンプレート調製およびIVTに使用