形状解析アルゴリズムは、2次元から3次元細胞培養への空間的形態と文脈を定量化し、表現型の新規定量化を可能にします

サマリー

本記事では、細胞やオルガノイドにおける新しい形態的特徴を、面積、体積、表面積などの従来の指標では捉えられない空間アルゴリズムである線形圧縮極座標変換(LCPC)を用いて定量化する方法を説明します。形状の向きやアライメントのベストプラクティスについても議論されています。

要約

多くの研究により、細胞やオルガノイドの形態表現型が抗がん剤に対する感受性と相関していることが示されています。しかし、従来の表現型測定方法は面積、体積、周囲、信号強度などの空間的指標に依存しており、これらは機能しますが限界があります。これらの手法は、左右利きの特性であるキラリティのような空間的文脈の重要な特徴を多く測定できません。体積はキラリティを記録するために使えません。なぜなら左と右の靴は同じ体積を持つからです。キラリティ、重力方向、極性軸といった空間的文脈は人間にとって直感的ですが、これまでの細胞生物学者、病理学者、放射線科医、機械学習の実務者が用いる従来の指標では、これらの基本的な概念を捉えきれていません。線形圧縮極座標変換(LCPC)は、他のどの指標とも異なる空間的文脈を捉えることができる新しいアルゴリズムです。LCPC変換は、等高線とグリッド線の交点を追跡するグリッドシステムを重ねることで、2次元(2D)の等高線を離散的な正弦波に変換します。この方法により、輪郭線は離散座標の対の列に変換され、独立座標(x座標)は2次元空間内の連続した位置に対応します。各従属座標(y座標)は、等高線と格子線の交点から格子系の原点または基準線までの距離から成り立つ。離散正弦波の形で、高速フーリエ変換がデータに適用されます。このようにして、2Dおよび3D細胞培養における細胞の形状を体系的かつ多次元的に表現し、治療抵抗性に関する洞察を明らかにする強力な定量的層化を可能にします。

概要

三次元(3D)オルガノイド培養は、生体内生物学の模倣において二次元(2D)細胞培養よりも優れていることが証明されています^1,2。オルガノイドは、効果的な治療のスクリーニングや^{疾患進行の}洞察を得るために、がん研究において不可欠な存在^{となっています。}がん生物学では、形態学の違いが細胞や組織の異なる生物学的挙動と相関することはよく知られていますが、この分野は従来の形状指標に依存しており、その範囲は限られています。本研究は、面積、体積、表面積といった従来の手法を凌駕し、前例のない精度で微妙な形態的特徴を客観的に定量化する新しい空間アルゴリズムを記述します。

線形圧縮極座標変換(LCPC)は、組織組織病理学で観察される複雑な形態を客観的かつ定量的に記述するために考案され、結腸ポリープ⁷のグレードアップを向上させることを目的としています。このアプローチを拡張して、双極性障害やアルツハイマー病などの脳病理における巨視的なMRI空間的特徴を捉えたいという思いから、さらに強化された拡張が行われました。本研究では、LCPC変換の2つのバージョン、すなわちパラレルグリッドシステムとラジアルグリッドシステムの適用に関するステップバイステップのプロトコルとベストプラクティスを説明しており、いずれもオープンソースのスクリプトとチュートリアル動画があります。

従来の幾何学的手法以外にも、細胞や臓器の複雑な形状を測定するのに効果的な抽象化が複数存在します。これには、離心率、歪み、コントラスト、峰度の測定に加え、円形性、非対称性、辺の不規則性、そしてグローバルな輪郭構造^8,9,10を捉えるためのゼルニケモーメントが含まれます。フラクタル解析はまた、複雑な輪郭線をスカラー値に還元するのにも有用であり、例えば輪郭線の不規則さを測るフラクタル次元や、等高線^11,12における不均一な隙間の現れを測定する欠損度などがあります。テクスチャの測定には、コントラスト、エネルギー、均質性、相関、エントロピーの測定にグレーレベル共現マトリックス(GLCM)法が人気^です。これらの手法はいずれも有益ですが、重力の方向や左利き・右利き、形状変化の方向に影響を与える中央支持構造の位置など、空間的な文脈を捉えるために設計されていません。さらに、多くは空間情報を表すために単一のスカラー値やごく少数のスカラー値を生成するため、引用された研究では複雑な形状を評価する際にこれらを組み合わせて使われることが多いのです。

LCPC変換は、1回の測定から多くの特徴を生成し、重力の方向など空間的文脈を形状に符号化する空間マーカーを追加できるように設計されました。LCPC変換⁷ に最も近い方法は、その¹⁵年後に発表され、同じ核心的な考え方を共有しています。それは、フーリエ変換をセルの輪郭線に適用し、周波数スペクトルの形で形状を測定することです。しかし、LCPC変換は独立した設計で、測定対象の形状外の空間的文脈の知識と組み合わせて適用されることを想定していました。さらに、LCPC変換の発明者はこの論文で、得られる周波数スペクトルには膨大な量の隠れた空間情報が含まれていると説明しています。 補足ファイル1 には、引用された手法を用いる際にしばしば見落とされがちな生物学における空間的文脈と、LCPC変換をどのように応用してこの文脈を捉えることができるかについての詳細な議論が含まれています。形状データで対照群と実験群の間に差が見られない読者、目で形の違いが見えないか、形状データでほとんど差が見られない人がいるなら、もっと大きな差があるはずなのにLCPC変換を試すべきです。

LCPC変換は、形状を多次元で表現するため、空間情報の測定において前例のない精度を提供します。従来の方法である面積や体積法のように、形状ごとに1つのスカラー値(すなわち25cm^²)しか得られませんが、LCPC変換の結果は複数の指標を生成でき、それぞれが形状の異なる形態的側面(例えば、角の丸みと鋭さ、滑らかさとエッジのギザギザ)に対応します。LCPC変換は、2D形状の等高線と交差する直線のグリッドを重ねて表現します。各グリッド系には、線形距離を測定するための原点(図1)または基準線(図2)があります。アルゴリズムを説明した簡略化されたフローチャートについては 図1B および 図2B を参照してください。グリッド線と形状の輪郭との間のすべての交点が検出されます。各交差点の距離は基準線または原点に対して計算されます。このようにして、LCPC変換は2次元形状を連続したx-y座標対の連続に変換します。x座標はグリッド線の位置を0から無限遠まで、y座標は交差点から基準線または原点までの距離を表します。この離散正弦波の形式では、高速フーリエ変換(FFT)を適用して「位置領域」から周波数領域に変換します。もしx座標が時間を表すならば、「位置領域」はFFTの標準的な応用における「時間領域」と同等になります。

放射状グリッド系は各交差点から放射状格子の原点からの距離を測定します(図1A)一方、平行グリッド系は常に形状の左側にある虚想線を参照して交差点の距離を測定します(図2A)。オープンソースのスクリプトは、輪郭線の最も左端のピクセルを見つけ、その位置から10ピクセル左に移動してこの仮想線の位置を決定します。ここで、この位置のx座標がすべての交点を計算する基準線となります。この10ピクセルルールは恣意的ですが、そのためオープンソースの平行グリッドシステムで解析されるすべての輪郭線には、4辺すべてに少なくとも15ピクセルの空白が必要です。

折りたたみや複数の層を持つ2D形状では、グリッド線が輪郭線と複数回交差することがあります。この場合、グリッド線上のすべての交差点の距離を1つの値に合計します。したがって、各グリッドラインはx座標とy座標のみを持ちます。この総和は、LCPC変換という名称の「圧縮」という用語で表されます。非線形の2D形状を離散的な正弦波に描画することは、アルゴリズム名の「線形化」という用語で表されます。最後に、「極座標」という用語は、最初に概念化されたグリッド系が極座標⁷の180度放射状グリッドであることに由来します。極座標とデカルト座標が互換可能であることに気づいた後も、アルゴリズム名はそのまま残されました。謝辞のセクションでは、LCPCトランスフォームの発明と拡張に動機づけられた個人的な理由が説明されています。

プロトコル1は 図3Bに示されるデータを取得するシーケンスであり、プロトコル2は 図3C–Dに示されるデータを取得するシーケンスでした。これらのプロトコルのステップは、GitHubリポジトリ「Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^」で利用可能な個別のPythonスクリプトで実装されています。プロトコル1は、LCPC変換に備えて「純粋な形状」を導出するための前処理ステップの一例です。プロトコル2は、形状を「スケールで」測定するための前処理ステップの一例であり、これは形状同士の元のスケールでの測定を指します。

セグメンテーションは、MacのPreviewやMicrosoftのPaintなどの画像処理ソフトウェアで手動で行うか、しきい値ベースの手法を用いて行うことができます。手動で行う場合は、青、緑、ピンク/マゼンタ、赤の4色のいずれかを選ぶべきです。GitHubリポジトリ「Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform」¹⁶ には「color extraction scripts」というフォルダがあります。このフォルダには、前述の4色を抽出し、白い背景に青いマスクに変換するPythonコード付きのJupyter Notebookファイルが4つ入っています。このプロセスは、Fiji/ImageJのような画像処理ソフトウェアで輪郭色の閾値を設定することでも実行できます。境界が接触したりエッジが重なったりする等高線(例:ベン図)を含む画像の場合、画像処理ソフトウェアで分離し、複数のオルガノイド輪郭を含む複合マスク画像内で独立したオブジェクトとなる必要があります。これは、接触しないオルガノイドが1つだけ、または複数のオルガノイドが接触しない画像には適用されません。

プロトコル

本研究で使用された一次ヒト細胞は、倫理承認およびインフォームドコンセント手続きのもとで取得・培養され、以前に報告された¹⁷細胞。ここに示した画像は、承認された細胞培養から生成され、初めて公表されています。組織標本は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびカリフォルニア大学サンフランシスコ校で、倫理審査委員会(IRB)承認のプロトコルのもと、研究用組織の使用に関するインフォームド・コンセントを提供した患者から採取されました。本研究では追加の人体標本採取は行われていません。

1. LCPC変換のための2次元オルガノイド輪郭の純粋な形状の抽出

1. MicrosoftのPaint、MacOSのPreview、Fiji/ImageJなどの画像処理ソフトウェアを使って、各オルガノイドの外縁をセグメント化してください。
2. オルガノイドの輪郭を、白い背景に青い線で開いたマスクとして抽出します。
3. それぞれの青い輪郭線をそれぞれの白いキャンバスに切り離します。
   注意:このステップは画像に複数の輪郭が含まれている場合のみ必要です。
4. 青いオブジェクトの四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各輪郭線をトリミングします。
5. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。
6. 物体を回転させ、最も長い内部長を水平にします。
   注意:このステップは、各オブジェクト内の最も長い内部線をオブジェクトの幅に変換します。この目的のために2つのスクリプトが用意されています。閉じた形状の場合は、「Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb」というJupyterノートブックを使います。開いている形状や複数のコンポーネントを持つ形状の場合は、「Rotate Green Line_v3.ipynb」というJupyterノートブックを使ってください。Rotate Green Lineツールには、.ipynbファイルと同じフォルダ内のReadMeファイルにリンクされたビデオチュートリアルがあります。
7. 青い物体の四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各画像をトリミングします。
   注意:これはステップ1.4と同じです。しかし今回トリミングする目的は、次に来るサイズ調整のステップで、青い物体だけでなくキャンバス全体のサイズを変えることです。したがって、青い物体をキャンバス本体とほぼ同じ幅と高さにすることで、キャンバス幅を400ピクセルにリサイズすると、オブジェクトの幅もほぼ400ピクセルにリサイズされます。「Trim margin to 1-pixel border.ipynb」というJupyterノートブックがあります。
8. 各画像のキャンバス幅を400ピクセルにリサイズしつつ、アスペクト比も制約します。
   注意:このステップで各オブジェクトの幅は同じになります。アスペクト比を制約することで、リサイズ時にオブジェクトが歪むのを防ぎます。JupyterのNotebookには「幅を400ピクセルにリサイズするが、アスペクト比を制限する.ipynb」という名前があります。
9. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。
10. 各画像を時計回りまたは反時計回りに90度回転させ、すべての画像で選択する中で最長の内部長さを垂直にします。
    注意:上記のシーケンスでは、純粋な形状はステップ1.6、1.7、1.8、1.9を順次実装することで得られます。ステップ1.9でマージンスペースを追加することは、次に行われるLCPC変換スクリプトの誤りを避けるために必要ですが、純粋な形状の抽出には関与しません。形状を「スケールで」測定したいユーザーは、上記のシーケンスのステップ1.6、1.7、1.8を実行する必要はありませんが、LCPC変換を適用する前に最適な向きを得るためにマスク画像の事前処理を行う必要があります。
11. 各等高線に対してLCPC変換を行います。放射状グリッドメソッド¹⁸または並列グリッドメソッド¹⁹用に提供されているPythonスクリプトを使用してください。

2. LCPC変換のための2次元オルガノイド輪郭のスケール形状の抽出

注:物体のスケール形状を抽出するステップバイステップの方法は、上記のプロトコル1の純粋な形状抽出方法に似ています。両プロトコルでは、マッチングを容易にするためにステップ名が同じです。各ステップについてはプロトコル1の注記を参照してください。純粋な形状と実際のスケール形状の主な違いは、実際のスケール形状にはサイズ調整のステップ1.6、1.7、1.8が不要であることです。

1. 各オルガノイドの外縁をセグメント化します。計算方法を使うか、MicrosoftのPaint、MacOSのPreview、Fiji/ImageJなどの基本的な画像編集ソフトを使って手動で行うこともできます。
2. オルガノイドの輪郭を、白いキャンバスに青い線で開いたマスクとして抽出します。マスクを抽出するにはFiji/ImageJを使うか、提供されているPythonスクリプト¹⁶を使います。
3. それぞれの青い輪郭線をそれぞれの白いキャンバスに切り離します。マスクを抽出するにはFiji/ImageJを使うか、提供されているPythonスクリプト¹⁶を使います。
4. 青いオブジェクトの四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各輪郭線をトリミングします。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
5. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
6. 各輪郭を回転させ、最長の内部線を垂直にします。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
7. 各等高線に対してLCPC変換を行います。放射状グリッドメソッド¹⁸ または並列グリッドメソッド¹⁹用に提供されているPythonスクリプトを使用してください。

結果

乳がんオルガノイドに適用された放射状グリッドLCPC変換

3Dオルガノイドや腫瘍は様々な形状を取ることができ、その中には人間の目とは明らかに異なるものもありますが、従来の指標では統計的に有意な差は見られません。一方で、オルガノイドは人間の目には異質で重要に感じられない形状を示すこともあり、異なる亜型を表す微妙な形態を繰り返し隠すこともあります。ヒト一次乳腺オルガノイドは患者から抽出され、既に発表されたプロトコル^17、20、21に従って3Dで培養されました。 図3A は、視覚的検査で確認可能な3つの形態的カテゴリーを示しています:嚢胞性表現型、多嚢胞性表現型、そして高密度多嚢胞性表現型です。 図3B...

ディスカッション

どんな計算ツールにも言えることですが、出力の品質は、入力がツール設計の基準となる予想されるルールに従っているかどうかに依存します。以下のルールに従い、提供されたPythonスクリプトを使用する際は品質管理のチェックとして使用してください。まず、オープンマスクが白い背景に青い線であることを確認しましょう。青は恣意的な決定であり意味はありませんが、LCPC変換を行うスクリプトは白い背景に青いピクセルを探すように書かれていました。次に、4辺すべてで10ピクセル未満の空白を持つ画像に対してLCPC変換スクリプトを実行しないでください。その理由についてはこの動画をご覧ください:「マージン厚みパラメータ - 形状の輪郭の準備方法」³³。三つ目に、このスクリプトはオブジェクトの輪郭が白い背景に青いピクセルであると仮定しています。線の太さは5〜10ピクセルの間であるべきです。その理由についてはこのビデオをご覧ください:「線太さパラメータ - 形状の輪郭の準備方法」³⁴。第四に、LCPC変換ス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	sklearn.neighbors パッケージ内の NearestNeighbors 関数を使用
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	scipy.spatial パッケージ内の cKDTree 関数を使用
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Python 言語で Cliff's Delta の実装を作成
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	手動セグメンテーションの潜在的な有用なツールとして言及されましたが、この研究では使用されていません
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	sklearn.decomposition パッケージの PCA 関数を使用
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook