自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

サマリー

このプロトコルは、産業用微生物向けの標準的な高スループットスクリーニングワークフローを提供します。これはARTP変異誘発による変異体ライブラリの構築、自動マイクロ流体解析による陽性液滴スクリーニングを行い、その後結果を検証する過程を含みます。ワークフローの信頼性は、高収量の B. coagulans 株のスクリーニングによって検証されました。

要約

産業用バイオマニュファクチャリングは、工学条件下で標的製品を効率的に合成するために微生物に依存しています。しかし、野生型株はその固有の代謝ネットワークのため、その能力を欠くことが多いです。したがって、大規模な変異体ライブラリーから高性能株を迅速かつ正確にスクリーニングすることは、産業微生物育種において極めて重要なステップです。近年、液滴マイクロ流体技術は高スループット、低消費量、単一細胞区画化能力により注目を集め、多数の単一細胞選別システムの開発につながりました。本研究では、自動化された液滴マイクロ流体プラットフォームを用いた産業用微生物株の高スループットスクリーニングプロトコルを提示します。統合されたワークフローは4つの主要段階から成り立っています。大気中および室温プラズマ(ARTP)変異誘発による変異体ライブラリの構築;高効率の単細胞カプセル化およびピコリタースケール液滴内での制御マイクロ培養;蛍光バイオセンサーの精密なピコ注入と蛍光活性化液滴選別(FADS)による高生成変異体を含む液滴の分離;そしてマイクロプレートおよびシェイクフラスコ発酵による選別された候補株の検証。完全かつ統合されたスクリーニングワークフローは標準化されたテンプレートとして意図されており、その検証はB . coagulans の高収率L-乳酸産生変異体の分離によって実証されています。この自動化された高スループットスクリーニングプラットフォームは、高性能株の産業的育種加速に大きな可能性を持つ強力な技術的ソリューションを提供します。

概要

産業バイオテクノロジーは、微生物や酵素を生物触媒として用いて、大規模に価値ある製品を生産しています。この方法は従来の化学製造よりも環境に優しく効率的と考えられています。しかし、微生物の自然な代謝ネットワークは、人間が望む効率的な合成物よりも、自らの生存と繁殖を優先するように進化してきました。その結果、厳格な条件^1,2,3の工業生産環境の要求を満たすために、高スループット微生物育種がしばしば必要とされます。このプロセスは、物理的または化学的変異誘発による大規模な微生物変異体ライブラリーの迅速な構築を含み、その後、異なる遺伝子型を持つ変異体の培養および表現型検出を行います。その後、優れた株のごく一部しか選ばれません。しかし、従来のプレートベースおよびマイクロプレートベースのスクリーニング技術は、手間がかかる手続き、低スループット、高コストにより妨げられています。このボトルネックと消耗品や試薬の大量消費が相まって、微生物育種の全体的な効率が低下しています^4,5。

最近、ドロップレットマイクロ流体法がこの課題に対する変革的な解決策として登場しました。蛍光活性化細胞選別(FACS)は分子が細胞外に急速に拡散するため分泌生成物のスクリーニングには適していませんが、蛍光活性化液滴選別(FADS)はピコリタースケールの区画化されたマイクロリア^{クター6,7,8}の単一細胞をカプセル化します。この物理的隔離により株間の競争を防ぎ、分泌代謝物の局所的な蓄積を可能にし、蛍光バイオセンサーによる定量的検出を可能にします。その結果、FADSはアミノ酸、有機酸、酵素など様々な細胞外産物の高スループットスクリーニングに理想的なプラットフォームであることが証明されています。あるチームは遺伝子コードされた蛍光バイオセンサーGECFINDERを開発し、FADSと組み合わせて高フェニルアラニン産生株をスクリーニングし、スクリーニング効率を1000倍以上向上させ^ました。別のグループは、蛍光活性化の液滴選別プラットフォームと遺伝子コードされたバイオセンサーを組み合わせたもので、大腸菌の3-脱水素シキミン酸産生株の高スループットスクリーニングを行い、最適化されたFADSシステムによりスクリーニング効率が大幅に向上し、生産が大幅に増加した変異株の分離が可能になりました¹⁰.一部の研究者はFADS技術をBst DNAポリメラーゼの工学に応用し、熱安定性と鎖置換活性が大幅に向上した獲得変異体をLAMP検出にさらに応用し、反応時間を40分から10分¹¹分に短縮しました。

しかし、これらの技術的進歩を日常的な産業ひずみ開発ワークフローに応用することは依然として困難です。多くの商業用液滴マイクロ流体システムは、高度なハードウェアを持ちながらも、微生物表現型スクリーニングに特化した完全で直感的かつ再現可能な標準操作手順を持たせていません。このギャップを埋めるために、モジュール式流体制御、ユーザーフレンドリーなソフトウェア、標準化されたチップ設計を統合した自動ドドロップレットマイクロ流体プラットフォームが採用され、完全統合されたスクリーニングワークフローの確立に理想的な技術的基盤が築かれました。本研究は、高収量のL-乳酸産生 B. coagulans の高スループットスクリーニングを検証ケースとして用いています。液滴マイクロ流体プラットフォームに基づき、以下のワークフローが確立され、4つの主要な連続ステップから成り立った:(1) 大気中および室温プラズマ(ARTP)変異誘発による多様な変異体ライブラリの構築;(2) B . coagulans の成長およびL-乳酸産生に最適な条件下での高効率単細胞カプセル化および液滴内での制御されたマイクロ培養;(3) L-乳酸特異的蛍光バイオセンサーの精密なピコ注入と、優れた生成物を被包する液滴の高速選別;(4) シェイクフラスコ発酵による選別候補の厳密な検証を行い、生産力の向上と遺伝的安定性の確認。このプロトコルは、産業微生物育種に従事し、細胞外産物の高スループットスクリーニングを必要とする研究者や技術者を対象としています。特に、小分子代謝物や酵素を分泌する培養可能な細菌に適しています。スクリーニングプラットフォームには、標的代謝物の特異的検出を可能にするため、液滴微小環境に対応したセンサーを装備する必要があります。特別な培養要件を持つ株(例:厳密嫌気性菌)では、培養パラメータを適応させて最適化し、専用の培養戦略を確立することができます。このクローズドループで標準化されたスクリーニングワークフローを確立することで、本研究は系統の産業的育種を加速させる強力かつ移転可能なソリューションを提供することを目指しています。

プロトコル

本研究には倫理承認は必要ありませんでした。すべての実験は純粋な微生物培養を用いて行われ、被験者や実験動物は関与していません。以下のプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 をご参照ください。

1. 準備

注意:バイオセーフティの遵守を必ず行ってください。 B. coagulans はバイオセーフティレベル1の生物です。手袋と白衣を着用してください。すべての開放操作は層流フード内で行われます。生セルに接触したすべての材料は、廃棄前に121°Cで20分間オートクレーブ処理してください。

1. ひずみ源とメンテナンス
   1. 商業用培養センターからB . coagulans ATCC 7050を第2世代の斜面培養として購入してください。
   2. スラント培養液をループ状にストライクし、50°Cで24時間培養します。単一のコロニーを選び、液体種子培地に接種し、50°C、200rpmで12時間育てます。
   3. 得られた培養液を無菌40%グリセロールと混合し、最終濃度25%(v/v)にし、–80°Cで冷凍ストックとして保存します。 各実験では、新鮮なアリコートを解凍し、それを種の中量の寒天にストリークし、50°Cで24時間孵化します。
   4. その後、単一のコロニーを選び、液体種子培地に接種し、50°C、200rpmで12時間培養した後、変異誘発とスクリーニングに使用されます(補足図1)。
2. 乳酸センサー
   1. 補足資料¹² (補足図2)に記載されているようにeLACCO1.1センサーを発現・精製してください。
   2. 精製したセンサーに5%(v/v)のグリセロールを補足し、–80°Cで保存します。 各実験では、氷上で1つのアリコートを解凍し、すぐに無菌の10 mM PBS(pH 7.4)で希釈し、最終作業濃度0.1 mg/mLにします。
3. 培養培地の調製
   1. 種子培地(g/L:グルコース20、酵母抽出物5、トリプトン10、酢酸ナトリウム2、クエン酸ナトリウム2、_K2HPO₄ 2、MgSO₄·7H₂O 0.2、MnSO₄·H₂O 0.05、FeSO₄·7H₂O 0.01)。グルコースは別に200g/Lのストックとして115°Cで20分間滅菌します。
      1. 残りの成分は121°Cで15分間オートクレーブ処理します。冷却後、最終濃度20 g/Lの無菌グルコースストックを加え、微量元素をろ過滅菌します。
      2. 培地全体を4°Cで最大1週間保存します。夜間の活性化や接種準備に使用します。
   2. スクリーニング培地(g/L:グルコース20、酵母抽出物6.66、NaCl 0.333、NH₄Cl 0.665、KH₂PO₄ 2、Na₂HPO₄ 4.46、MgSO₄ 0.12、CaCl₂ 0.074)。
      1. グルコースは115°Cで別々に20分間滅菌します。塩と酵母エキス混合物を121°Cで15分間オートクレーブします。
      2. 冷却後、滅菌グルコースストックを20g/Lに加えます。4°Cで最大1週間保存します。液滴生成のための水相として、また10時間の培養期間中に液滴内の培養培地として使用します。
   3. 発酵培地(g/L:グルコース90、トリプトン13.33、酵母抽出物13.33、酢酸ナトリウム0.67、NaCl 0.0133、MgSO₄·7H₂O 0.0133、MnSO₄·H₂O 0.0133、FeSO_{4.7H 2}O 0.0133)。
      1. グルコースを500 g/Lのストックとして115°Cで20分間滅菌します。他の成分は121°Cで15分間オートクレーブします。
      2. 冷却後、滅菌グルコースストックを90g/Lに加えます。接種直前に滅菌_CaCO3 粉末(4% w/v)を加えてpHを緩衝させます。毎日新鮮に準備してください。マイクロプレートの一次スクリーニングおよびシェイクフラスコ検証に使用されます。
         注意:蒸留水で最終体積1リットルまですべての培地を準備してください。pHを1 M HClで6.5に調整してください。

2. ARTPを用いたミュータントライブラリの構築

注意:ARTPの動作には高周波プラズマとUVランプが必要です。紫外線は目や皮膚の損傷を引き起こすことがあります。プラズマ放出はオゾンと高温を発生させます。プラズマが稼働している間は、チャンバーの扉は常に閉めておくこと。白衣とUV遮断ゴーグルを着用してください。純粋なヘリウムは99.999%のみ使用し、十分な換気を確保しましょう。各変異誘発手術後は、75%(v/v)エタノールに浸した綿くずのない布で作業台と変異誘発チャンバーの内壁を拭きます。75%のエタノールは非常に可燃性です。火や火花、高温の表面からは避けましょう。

1. OD₆₀₀ と生存可能な細胞濃度を相関させる標準的な曲線を確立します。
   1. B . coagulans の単一コロニーを種子培地に接種し、50°C、200rpmで12時間培養し、培養が中間対数段階に達するまで行います。
   2. 細菌懸濁液を10⁴、10⁵、10⁶の勾配で連続希釈します。
   3. 各希釈液を100μLピペットで抽出し、三重に種培地の寒天プレートに均等に広げます。
   4. すべてのプレート入り寒天プレートを50°Cで24時間培養します。
   5. 各希釈ごとにコロニー形成単位(CFU)を数えます。
      注:校正の結果、OD₆₀₀ = 0.5は約1 ×¹⁰ 8 CFU/mLに相当します。この関係を用いて、滴被覆の初期細胞密度を決定します(補足図3)。
2. 培養B. は中期から後期の対数段階まで凝 固 し、その後新鮮な種子培養を新鮮な種子培地でOD₆₀₀ = 0.05まで希釈します。
3. 層流フードの内側で、8つの滅菌された小さな金属ディスクと1つの大きな金属ディスクを準備します。8枚の小さなディスクをアルコールバーナーで1分間焼き、滅菌された大きなディスクの上に置いて10分間冷ます。
4. マイクロピペットを使い、希釈した細菌懸濁液10μLを8つの冷却された小さなディスクそれぞれに均一に塗布します。
5. 接種済みの小さな椎間板を大きな椎間板を無菌のペトリ皿に移します。
6. ARTP計器の電源を入れてメインコントロール画面を起動してください。変異誘発チャンバー内のUVランプを点けてください。チラーを起動し、20分間予冷して温度が20°Cに安定するまで加熱します。
7. 急いで変異誘発チャンバーの扉を開け、小さな円盤を中に入れます。
8. 滅菌鉗子を使い、各小さな椎間板を順次ARTPサンプルステージに移します。
   注:RF出力、ヘリウムガス流量、ノズルから試料までの距離、ヘリウム純度はそれぞれ120W、10 SLM、2 mm、99.999%に固定されています。ヘリウム照射時間はそれぞれ5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒に設定されました。
9. 各小さな椎間板を設定パラメータに従ってARTP変異誘発作用を施します。照射後、すべてのディスクを10mLの回収培地を含む50 mL遠心分離機チューブに移します。細胞の回復と成長を促すために、50°Cで200rpmの振動を伴い4時間培養します。
10. 致死率の決定。
    1. 回収した培養液を^10-2 から^10-6の勾配まで連続的に希釈します。
    2. 各希釈液を100μLを種子培地寒天プレートに広げ、各希釈ごとに3回の複製を準備します。
    3. すべてのプレートは50°Cで24時間培養します。
    4. コロニー数を数え、対応するCFU/mLを計算します。
    5. 致死率は次の式で計算します:
       (1)
       注意:実験は各時間点ごとに三重に行ってください。この場合、ARTPの最適な変異誘発時間は20秒です(補足図4参照)。

3. 自動液滴マイクロ流体プラットフォームおよび消耗品の組成

1. 作動系(図1)
   注:これは0–1000 mbarの圧力範囲を持つ3チャンネルの高精度圧力コントローラーで構成され、圧力応答時間は< 50 msです(図1A)。
2. イメージングシステム
   注:高速CMOS顕微鏡イメージングは、≥ 2 GB/sの高速画像データ取得、0–20,000 fpsのフレームレート、最大解像度1280 x 860を特徴としています。このシステムは、液滴の動きをリアルタイムで観察するためのオートフォーカス機能を備え、画像や動画の録画をサポートしており、BMP、AVI、MP4、TIFなど複数のフォーマットでエクスポート可能です。
3. 検知システム
   注:2つのレーザー(488 nmと633 nm、2つの検出チャネル)による蛍光信号検出を可能にします。
4. ホスト制御システム
   注:自動ドドロップレットマイクロ流体プラットフォームソフトウェアによって制御され、このシステムは流体作動、顕微鏡イメージング、励起・検出、液滴生成、ピコ注入、選別など複数のモジュールを統合しています。また、実験データの取得、記録、保存、表示、エクスポートもサポートしています。自動液滴マイクロ流体プラットフォームの部分的な動作ユニットは図1Bに示されています。
5. 消耗品
   注:本プロトコルで使用される消耗品には、油相、試料、試薬用の注入チューブ(図2A)、液滴培養用の採取管(図2B);液滴生成チップ(図2C);液滴ピコ注入チップ(図2D);および液滴選別チップ(図2E)です。

4. 液滴生成

注意:自動液滴マイクロ流体プラットフォームを清掃してください。各実験後は、ステージ、チップホルダー、こぼれた部分を75%エタノールで綿のないワイプで拭き取ります。残留フッ素油、セル懸濁液、またはセンサー溶液を除去してください。

1. 単一セルカプセル化。14 pLの液滴でλ = 0.1を得るために、細菌懸濁液をOD₆₀₀ ≈ 0.04に希釈します(OD₆₀₀=0.5は1 ×^{10 8} CFU/mLに相当します)。ポアソン分布によると:
   (2)
   λ = 0.1の場合、90.5%の液滴が空で、9.1%が単一細胞、0.4%が複数の細胞を含みます。
   注:この場合、測定された単一細胞カプセル化効率は11.2%でした(補足図5参照)。1滴あたりの細胞数はDAPI染色によって決定できます。λ = 0.1で多細胞カプセル化率が1%を超える場合、OD₆₀₀₀を下げて、複数のセルを含む液滴の割合を減らす必要があります。
2. 油相入口バイアルに300μLのフッ素油をピペットで注入します。細菌懸濁液500 μLを水相入口バイアルにピペットで移します。
3. 液滴生成チップの表面を覆っていたテープを剥がしてください。オイルバイアル、サンプルバイアル、収集バイアルを順番にチップの対応する井戸に接続します。
4. チップをステージに置いて固定します。ガス経路のラベルに従って、エアチューブをインレットバイアルに一つずつ接続します。
5. 自動ドロップレットマイクロ流体プラットフォームのソフトウェアを開きます。チップの矢印方向に合わせてステージムーブの動きノブを調整し、視野をドロップレット生成地点に移動させます。
6. 自動液滴マイクロ流体プラットフォームソフトウェアの「Droplet Generation」インターフェースで「Start」をクリックしてください(図3A)。イメージングインターフェースで「Z軸」と光源の明るさスライダーをドラッグすると、画像の鮮明さと明るさを調整します。
7. 「Droplet Speed」と「Droplet Size」の「+」と「-」ボタンをクリックすると、生成速度とドロップレットサイズを調整できます。
   注:この場合、液滴生成のための油相圧力と試料相圧力は自動的に300 mbarと400 mbarに設定され、1500 Hzの生成速度を実現します。これらの設定では、液滴の体積は14 pLで、液滴径のCVは5%未満に保たれ、安定した液滴サイズと信頼性の高い下流作業が保証されます。
8. 機器が安定し、ドロップレット生成状態が一定になるまで1分間待ちます。すぐに採取バイアルを元に戻して、滴の採取を開始します。
   注意:新しい収集管には少量のフッ素油をあらかじめ加え、テフロン管の下部ポートを覆い、滴が管壁に直接接触して融合を起こさないようにしてください。
9. 操作開始から30分後に飛沫の収集を停止してください。ポップアップウィンドウで「停止」をクリックして、ドロップレット生成の停止を確認してください。
10. 集水チューブをチップから優しく取り出します。チューブと採集バイアルを垂直に置き、チューブ内の滴が採集バイアルに入るのを待ちます。
11. チップ、オイルフェーズインレットバイアル、水相インレットバイアルをステージから取り外します。ステージの表面を75%アルコールで拭き取る。その後、液滴生成段階が完了します。

5. 水滴培養

1. 採取チューブに1mLのミネラルオイルを加えます。
   注:鉱物油層は液滴懸濁液を覆い、蒸発を最小限に抑え酸素曝露を減らしつつ、兼性嫌気性菌 B.コアグランの十分なガス交換を可能にします。
2. 収集チューブを無菌水を入れた15mLの遠心分離機チューブに立てて置きます。採集チューブはゆるく蓋を閉め、45°Cで10時間培養します。
   注意:インキュベーション後、液滴径のCVが<10%であることを確認し、液滴の凝集が観察されないことを確認しましょう。これらの条件を満たしていない場合はバッチを破棄してください。

6. 液滴ピコ注入

注意:ピコ注入中は計器接続を通じてチップ電極に高電圧が加わる。電場は激しい感電を引き起こすことがあります。高電圧が作動している間は、金属工具や素手で電極やチップ表面に触れないでください。チップを扱う前に必ず高電圧出力を無効にしてください。断熱手袋を着用し、非導電性の工具を使いましょう。

1. オイルフェーズのインレットバイアルを準備してください。層流フード内に、油相入口バイアルに300μLのフッ素油をピペット注ぎます。
2. サンプルの入口バイアルを準備しろ。滴が入っている収集チューブから吸入バイアルキャップを外してください。新しいキャップに交換してください。
3. 新しいインレットバイアルの先端をトリミングします。新しい入口バイアルの前端から少し切り、先端がサンプルバイアル内の液滴の液位より下になるようにします。
4. キャップを締めろ。漏れを防ぐためにキャップをしっかり固定してください。
5. 試薬入口バイアルを準備しろ。乳酸センサーの500μLを試薬入口バイアルにピペットで移します。
6. 試薬入口バイアルにPBSを加えてください。同時に、同じ試薬入口バイアルに500μLの滅菌PBSバッファを追加します。
   注:この実験では、液滴のpHバランスを取るためにPBSバッファーが加えられています。ラクトレートセンサーの最終作動濃度は0.1 mg/mL、ラクトレートセンサーの負荷容量は500 μLでした。
7. 刃を使って電極ウェルを覆うテープを切り裂き、電極を露出させます。マルチメーターを導通モードに設定し、回路接続とチップのショート状態をテストします。
   注意:マルチメーターでチップ電極の回路接続が正常であれば、次のステップに進みましょう。回路が開いている場合は、注入チップを交換して再度テストしてください。
8. マルチメーターで正常な回路接続を確認した後、チップ表面のテープを剥がしてください。オイルバイアル、サンプルバイアル、試薬バイアル、収集バイアルを、チップの対応するウェルに順番に接続します。
9. チップをステージに置いて固定します。ガス経路のラベルに従って、エアチューブをインレットバイアルに一つずつ接続します。
10. 自動ドロップレットマイクロ流体プラットフォームのソフトウェアを開きます。チップの矢印方向に従ってステージムーブノブを調整し、視野をドロップレットチップの電極領域に移動させます。
11. 自動ドドロップレットマイクロ流体プラットフォームソフトウェアの「Droplet Pico-injection」インターフェース(図3B)で「スタート」をクリックしてください。イメージングインターフェースで「Z軸」と光源の明るさスライダーをドラッグすると、画像の鮮明さと明るさを調整します。
    注:この時点で、装置は自動的にオイルフェーズポンプ圧力を400mbar、試料フェーズポンプ圧力を420mbar、試薬注入フェーズポンプ圧力を450mbarに調整します。
12. 手術初期段階では、カテーテル内の空気の一部がチップ内に放出されます。これは数分間続く通常の現象です。
13. 水滴が視界に入るのを待ちます。「ピコ注射開始」をクリックしてください。この時点で機器の電場が活性化されます。「ドロップレット速度」、「液滴間隔」、「注入体積」の「+」と「-」ボタンをクリックして、ドロップレット生成速度、ドロップレット間隔、注入量を調整します。
    注意:電場はデフォルトの最大ギアに設定されています。核融合過程で電場領域で水滴が破れた場合は、中速または低速ギアに切り替えます。この場合、液滴注入速度は200Hzでした。
14. 高速画像表示ソフトウェアで観察してください。もし液滴が1:1の比率で乳酸センサーに安定して注入できるなら、機器が安定するまで5分待ちます。すぐに採取バイアルを元に戻して、滴の採取を開始します。
15. 安定注射を2時間続けた後、「停止」をクリックしてピコ滴注射を終了します。
16. 集水チューブをチップから優しく取り出します。チューブと採集バイアルを垂直に置き、チューブ内の滴が採集バイアルに入るのを待ちます。

7. ドロップレットソート

注意:脱乳剤は刺激物であり、皮膚や目の刺激を引き起こす可能性があります。また、吸入や飲み込むと有害です。必ず適切な個人用防護具(手袋、白衣、安全ゴーグル)を着用してください。脱硫剤は換気の良い場所や排気フードで扱ってください。廃棄物の乳酸剤は、明確にラベルが貼られた別の容器に集めてください。シンクに注いではいけません。

1. 層流フード内で、300μLのフッ素化油をピペットに入れ、油相の入口バイアルに加えます。マイクロ注入された液滴を含む採取チューブの入口バイアルキャップを新しいキャップに交換してください。
   注意:液滴選別実験を行う前に、5μLの液滴を取り、蛍光顕微鏡で観察してください。少なくとも200個の水滴の直径を測定してください。履歴書が10%<まで進めてください。
2. 刃を使って電極ウェルを覆うテープを切り裂き、電極を露出させます。マルチメーターを導通モードに設定し、回路接続とチップのショート状態をテストします。
3. マルチメーターで正常な回路接続を確認した後、チップ表面のテープを剥がしてください。オイルバイアル、サンプルバイアル、選別バイアルをチップの対応するウェルに順番に接続します。
4. チップをステージに置いて固定します。ガス経路のラベルに従って、エアチューブをインレットバイアルに一つずつ接続します。
5. 高速イメージングソフトを開け。チップの矢印方向に従ってステージムーブノブを調整し、視野をドロップレットチップの電極領域に移動させます。
6. 自動ドロップレットマイクロ流体プラットフォームソフトウェアの「Droplet Sorting」インターフェースで「Start」をクリックしてください。イメージングインターフェースで「Z軸」と光源の明るさスライダーをドラッグすると、画像の鮮明さと明るさを調整します。
   注意:「スタート」をクリックすると、機器は自動的にオイルポンプ圧力を300 mbar、試料ポンプ圧力を190 mbarに調整し、液滴の処理速度は100 Hzとなります。
7. 手術初期段階では、カテーテル内の空気の一部がチップ内に放出され、数分間持続する現象としては正常な現象です。
8. 「レーザー」を選択し、488nm検出チャネルを選択してください。
   注:実験担当者は、実験検出設計に応じて488 nmレーザー、633nmレーザー、またはその両方の組み合わせを選択できます。レーザー出力:20 mW。
9. 「データ記録」をクリックしてください。装置は液滴蛍光信号の取得を開始します(図3C)。
   注意:蛍光信号は50,000から100,000個の液滴を収集してください。機器は信号値を自動的にソートし、蛍光信号ヒストグラムを生成します。
10. 生成された蛍光信号ヒストグラムに基づき、ソート閾値を全蛍光信号の上位0.1%に設定し、その閾値を超える蛍光信号値の滴を収集します。
    注:この場合、ソーティングゲートは蛍光>強度2750(a.u.)のドロップを収集するように設定されており、これはドロップレットの上位0.1%に相当します。
11. もう一度「データ記録」をクリックしてください。装置は残った液滴からの蛍光信号を再記録し、セクション7.10で設定された閾値に基づいて目標液滴を選別します。
    注:残りの液滴信号も自動的に分類され、蛍光ヒストグラムとしてプロットされます。
12. ターゲットの水滴領域を選択した後、「ソーティングスイッチ」をオンにし、「偏向力」値を設定します。機器が水滴の仕分けを始める。
    注:この機器は3つの選択可能な電界強度レベル(高、中、低)を提供します。30μmを超える液滴の場合はHighを選択してください。25μm未満の液滴の場合は、中または低を選択。これにより安定したたわみと最適なソーティング効率が保証されます。
13. 機器が5分間安定したら、採取バイアルを交換して陽性のドロップを採取します。
    注:選別中、機器は各液滴の蛍光強度をリアルタイムで継続的に測定し、設定した閾値と比較します。閾値を超える蛍光強度の液滴のみが偏向させられ、正の収集管に集められます。液滴は、機器が選別閾値を超える蛍光信号を示し、同時にイメージングインターフェースで液滴の偏向が観測され、液滴が正の収集チャネルに成功裏に導かれていることが確認された場合、その液滴は正と見なされます。
14. 4時間の安定した稼働後にドロップレットのソーティングを停止してください。「Droplet Sorting」インターフェースで「Stop」をクリックします。
15. 集水チューブをチップから優しく取り出します。チューブと採集バイアルを垂直に置き、チューブ内の滴が採集バイアルに入るようにしてください。
16. 液滴採取が完了した後、散乱図をクリックすると実験の散乱図、選別済みの正の液滴の蛍光信号値、全液滴の蛍光信号値が保存されます。
17. チップ、オイルフェーズインレットバイアル、サンプルバイアル、試薬バイアルをステージから取り出します。ソフトウェアを閉じてください。
18. 液滴の脱乳化。1H、1H、2H、2H-ペルフルオロオクタノールを500μLの液滴収集管に加えます。5分待ってから、500μLの新鮮スクリーニング培地を加えて回復します。
    注意:除乳剤を加えた後は収集チューブを激しく振らないでください。優しく混ぜて。液滴の脱硫後、水相と油相の間に明確な界面が形成されます。
19. 20μLの脱硫細菌懸濁液を取り、10倍に薄めて2つの寒天プレートに広げます。50°Cで2日間孵育します。
    注意:希釈係数は収集された滴数に応じて調整される場合があります。この場合、2枚のプレートから約400個の単一コロニーが得られました。

8. データエクスポート

1. ソフトウェアのソートインターフェースの空白部分にある蛍光信号プロットをクリックしてください。液滴蛍光信号散乱図、蛍光信号ヒストグラム、蛍光信号Excelスプレッドシートを保存してください。これらは全液滴数の蛍光強度値と、スクリーニング済み陽性液滴の蛍光強度値を含むものです。

9. マイクロプレート一次スクリーニング

1. 単一コロニーはランダムに選びましょう。
2. 24ウェルの深ウェルプレートに膨張培養用の接種を行います。選ばれた各コロニーを選び、2mLの発酵培地を含む24ウェルの深ウェルプレートの1つのウェルに接種します。接種ループを使いましょう。
3. 24ウェルの深ウェルプレートを非通気膜で密封してください。
   注意:通気性のある膜は使用しないでください。培養培地の蒸発を引き起こします。
4. 拡大文化を育てる。密閉された24ウェルの深ウェルプレートを50°C、200rpmのシェイキングインキュベーターに24時間置きます。
5. 発酵検証のためのサブカルチャー。24時間後、各ウェルから200μLの培養液を、1.8mLの発酵培地(10% v/v接種量)を含む新しい24ウェルの深ウェルプレートに移します。接種前に各ウェルに最終濃度4%(w/v)の滅菌_CaCO3 を加え、pHを緩衝します。
6. コントロールも含めてください。各新鮮な24ウェルの深ウェルプレートに、親株ATCC 7050を陰性対照としてランダムに選ばれた3つのウェルを充填します。候補株と同じように処理してください。
7. 24ウェルの深ウェルプレートを非通気膜で密封してください。
8. 24ウェルの深ウェルプレートをインキュベートします。密封されたプレートを50°C、200rpmのシェイキングインキュベーターに24時間置きます。
9. 乳酸検出用のサンプルを準備してください。プレートを5,842 × g で10分間遠心分離します。上清液10μLを96ウェルの黒色マイクロプレートに移し、990μLの超純水で希釈します。よく混ぜて。
10. 乳酸センサーを追加してください。希釈したサンプルを、新しい96ウェルの黒色板の各ウェルに100μL加えます。次に乳酸センサーを100μL加えます。優しく混ぜてください。
11. 蛍光を測定する。皿を室温で5分間(光を遮断して)孵化させます。マイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定し、励起は485 nm、放出は515 nmです。
12. ヒット選択の閾値を設定してください。3つの親対対照ウェル(親)の平均蛍光と標準偏差(SD_parent)を計算します。閾値をF_parent + 3 × SD_parentと定義します。
13. 一次ヒットを特定しろ。候補株は蛍光信号が閾値を超える場合、一次ヒットとみなされます。下流検証のために一次ヒット数を記録します。

10. 高収量株の二次検証

注意:移動相には希薄硫酸(5 mM)が含まれており、腐食性があります。皮膚への接触や吸入は避けてください。適切な個人用防護具(手袋、白衣、安全ゴーグル)を着用してください。移動相は換気の良い場所や排気フードで準備し、取り扱いましょう。酸を含む廃棄物はすべて専用の酸廃棄物容器に集め、適切に処分してください。シンクに注いではいけません。

1. 種の培養を準備してください。ストリークは主たるものが種子の培地に押し付けられます。50°Cで24時間培養します。各プレートから1つのコロニーを取り、250mLのシェイクフラスコに30mLの液体種子培地に接種します。50°C、200rpmで12時間孵化します。
2. 発酵の準備をしてください。発酵培地を準備し、pH中和剤として最終濃度4%(w/v)の無菌CaCO3粉末を加えます。種子培養液5mLを、250mLのエルレンマイヤーフラスコ(10% v/v接種量、最終作業量50mL)内のこの培地45mLに転移します。
   注意:候補株ごとに独立フラスコを3つ、親株はATCC 7050を対照として使用してください。
3. フラスコを孵化させてください。フラスコを50°C、200rpmのシェイキングインキュベーターに入れます。24時間発酵。
4. サンプルを採取しろ。24時間後、各フラスコから1mLの培養液を取ります。遠心分離機で13,800 g ×2分間。上清液を超純水で100倍に薄め、0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
5. HPLC条件を設置してください。AminexのHPX-87Hカラムを使いましょう。移動相を製備します:超純水に5 mM H₂SO₄を使い、0.22 μmの膜を通してろ過し、超音波処理で脱ガスします。カラム温度を40°C、流量を0.6 mL/min、注入容積を20 μL、稼働時間を1サンプルあたり20分に設定します(乳酸は約12,600分で溶出します)。屈折率検出器(RID)を使用してください。
6. 標準カーブを準備してください。カルシウムL-乳酸を超純水に溶かし、0、0.4、0.8、1.2、1.6 g/L(カルシウムL-乳酸として表される)の標準溶液を準備します。各標準を三重に注入してください。
   注:ピーク面積を濃度に対してプロットし、線形回帰方程式(R² > 0.999)を求めます。各サンプルバッチの開始と終了時に標準基準を使い、ドリフトを補正してください。
7. サンプルを注入してください。ろ過した発酵上清液(20 μL)をHPLCシステムに注入します。カルシウムL-乳酸ピークのピーク面積を記録します。
   注意:システムの安定性を監視するために、10サンプルごとに品質管理サンプル(1g/LカルシウムL-乳酸)を注入してください。許容される保持時間シフトは初期校正標準と比較して<0.2分、ピーク面積変動<5%です。
8. L-乳酸収率を計算してください。各試料のピーク面積を標準曲線に補間して、カルシウムL-乳酸濃度(g/L)を求めます。
   注意:分子量比を用いてL-乳酸濃度に換算してください:
   (3)
   改善率を計算します:
   (4)
9. 最終的な高収量株を特定してください。親株よりも一貫して高いL-乳酸産出を示す株を、検証済み変異体として選択します。さらなるキャラクター化のために最も優れたパフォーマーを選びましょう。

11. 高収量株の遺伝的安定性評価

1. 選ばれた変異株を種子中寒天プレートにストリークします。50°Cで24時間培養します。これは第1世代です。
2. 第1世代プレートから1つのコロニーを選び、50mLのチューブ内の液体種子培地5mLに接種します。50°C、200rpmで12時間培養し、F1種子培養を得ます。
3. 第1世代の種子培養液の10%(v/v)を、250mLのシェイクフラスコ内の発酵培地(4% w/v 滅菌CaCO₃を含む)に移します。50°C、200rpmで24時間孵化します。
4. 発酵後に1mLの培養液を採取します。13,800 × g で遠心分離機で2分間加熱し、超純水で上清液を100倍に希釈し、HPLCでL-乳酸濃度を測定します。世代ごとに独立したフラスコを3つ使います。
5. 次世代を得るには、第1世代の培養液を新鮮な種培地にストリークします。50°Cで24時間培養します。第2世代のためにステップ11.2と11.3を繰り返します。
6. サブカルチャーのプロセスを繰り返して第3世代と第4世代を得ます。各世代ごとに3つのシェイクフラスコを準備し、HPLCによる乳酸生成を測定します。
7. 4世代(1〜4世代)の収率を一方向ANOVAまたは学生のt検定を用いて比較します。世代間で乳酸産生に有意な差(p > 0.05)が見られない場合、この系統は遺伝的に安定していると考えられます。

結果

自動液滴マイクロ流体プラットフォームに基づき、高スループットスクリーニングモデルが確立されました。ARTP変異誘発によって最適な照射時間20秒のB . coagulan の変異ライブラリが構築され、致死率は約90%に達しました(図4A)。変異細胞は14 pL、直径約30 μmの液滴にカプセル化され、生成速度は1500 Hz(図4B)でした。45°Cで10時間インキュベーションした後、センサーは各液滴に200Hzの速度でピコ注入されました(図4C)。蛍光活性化された液滴選別は、488 nmレーザーを用いて100 Hzで実施されました(図4D)。選別された陽性の液滴は乳酸化され、検証のために単一コロニーが選ばれました。採取された菌落は、24ウェルの深ウェルプレートで最初に50°C、200rpmの発酵培地を24時間培養しました。各ウェルの蛍光は、励起波長485 nmおよび発光波長515 nmでマイク...

ディスカッション

このプロトコルは、自動化された液滴マイクロ流体プラットフォームに基づく産業用微生物スクリーニングの標準化されたワークフローを提供します。統合ワークフローには、変異体ライブラリの構築、液滴生成と単一細胞封装、マイクロリアクター培養、バイオセンサー注入、蛍光活性化液滴選別、ターゲット株の最終検証が含まれます。高収率のL-乳酸産生B. coagulansの高スループットスクリーニングを検証ケースとして用い、このワークフローはB. coagulans系統改善の文脈で従来のマイクロプレート法や寒天プレート法に比べて多くの利点を示しました。スクリーニングスループットと効率の面では、このプラットフォームはマイクロフルイディックチップを活用し、毎秒数千から数万個の液滴を並列で生成・処理し、従来のマイクロプレート方式と比べて単回スクリーニング処理量を約10/⁴倍に増加させ^{ています。} B. coagulansの場合、このワークフローは4時間以内に10個^の6<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	固体プレートの準備用
無水エタノール	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	実験台と機器の拭き取りと消毒用
大気および室温プラズマ（ARTP）	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	変異原性ライブラリの構築にARTPが使用されました。
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050は、変異原性および高スループット液滴スクリーニングのターゲットとして開始株として使用されました。
ブラックマイクロプレート（96ウェル）	Corning	3925	96ウェルブラックマイクロプレートは、乳酸センサーアッセイと乳酸濃度測定に使用されました。
炭酸カルシウム	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	L-乳酸ハイパープロデューサーの分離用
塩化カルシウム	Sinopharm	10005819	塩化カルシウムは、微生物の培養培地の調製に使用され、微生物の成長に必要な栄養素を提供します。
L-乳酸カルシウム	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	検出プロセスにおける標準曲線調製のサンプルとして使用されます。
遠心管（15 mL）	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	細菌液の希釈用
収集管	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	液滴の収集とその後の培養用
コンピュータ	Lenovo	E450	ソフトウェアのインストールとDREM Cell制御。
DAPI	Solarbio	c0065	細胞染色用
ディープウェルプレート（24ウェル）	BKMAMLAB	110424008	ディープウェルプレートを使用したB. coagulans変異体の初期収率検証用
乳化防止剤（1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクタノール）	MACKLIN	H817022	液滴乳化防止剤は、水中油マイクロ液滴を破壊し、内部の細胞、株、または上清を解放して、その後の検出と分析に使用されます。
D-グルコース	Solarbio	G8150-1000	D-グルコースは、微生物の培養培地の調製に使用され、微生物の成長に必要な栄養素を提供します。
クエン酸ジアンモニウム	Solarbio	D9950	クエン酸ジアンモニウムは、微生物の培養培地の調製に使用され、微生物の成長に必要な栄養素を提供します。
無水重リン酸カリウム	Sigma-Aldrich	P8281	無水重リン酸カリウムは、微生物の培養培地の調製に使用され、微生物の成長に必要な栄養素を提供します。
DREMソフトウェアバージョン	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	DREMセル機器の制御用。DREMソフトウェアは、Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.によるDREMセル機器専用の専有商用プログラムです。公式アクセスやダウンロードURLは公開されておらず、機器とともに認可された条件下でのみ配布されます。
液滴捕捉マイクロ流体セルソーター（DREMセル）	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	変異体ライブラリから高収率株を迅速にスクリーニングするために、高スループット単細胞封入および分類に使用されました。
液滴生成チップ	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	液滴生成チップは、単細胞封入用にモノディスパースなピコリット（pL）スケールの液滴を生成するために使用されます。
液滴注入チップ	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	液滴マイクロ注入チップは、事前に形成された液滴に精密かつ微量の試薬を注入し、その後の生化学反応を実現するために使用されます。
液滴分類チップ	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	液滴分類チップは、蛍光信号に基づいて高収率細胞を含む対象液滴を分類するために使用されます。
エルレンマイヤー振とう瓶（250 mL）	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	ディープウェルプレートによる一次スクリーニング後のB. coagulans変異株のスケールアップ培養検証に使用され、高収率株の安定性と再現性を確認します。
フィルター膜（0.22 μm）	Merck	SLGPR33RB	発酵液のろ過用
蛍光倒立顕微鏡	Olympus	IX73	Olympus IX73蛍光倒立顕微鏡は、液滴内の細菌形態の観察に使用されました。
フッ素化油	Bio-Rad	1864006	フッ素化油は、水中油マイクロ液滴を安定、一様、干渉しないものとして生成するドロップレットマイクロ流体の連続相として機能し、単細胞培養とスクリーニングをサポートします。
高性能液体クロマトグラフィーカラム	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	発酵液中の乳酸を、その異なる保持特性に応じて他の成分から分離し、乳酸の正確な定量検出を実現します。
高性能液体クロマトグラフィー	Shimadzu	228-34001-02	HPLCは、発酵サンプルにおけるL-乳酸の定量検出と分析に使用されます。
注入管	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	油相、サンプル細菌懸濁液、試薬溶液の注入用
硫酸鉄(III) 七水和物	硫酸鉄(III) 七水和物	硫酸鉄(III) 七水和物	硫酸鉄(III) 七水和物
ラミナーフローフード	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	B. coagulansの培養と発酵における無菌操作用
硫酸マグネシウム七水和物	Sinopharm	10013018	酵母エキスは、微生物の培養培地の調製に使用され、微生物の成長に必要な栄養素を提供します。
硫酸マンガン一水和物	MACKLIN	M813856	硫酸マンガン一水和