メンデルランダム化、共局在、データに基づく要約的ランダム化、薬剤予測を用いた心不全の標的探求

サマリー

本研究では、遺伝解析を通じて心不全の8つの潜在的な薬剤標的を特定し、これらに関連する治療薬候補化合物を探りました。

要約

心不全(HF)は、進行した段階で生活の質を著しく低下させる一般的な心血管疾患です。現在のさまざまな治療戦略にもかかわらず、HFの疾患負担は依然として重大です。したがって、新しい治療標的の探求が緊急に求められています。本研究では、メンデルランダム化(MR)を用いて、薬剤化可能な遺伝子とHFの因果関係を評価しました。共局在解析および要旨データベースのメンデルランダム化(SMR)を用いて、両者の関係をさらに検証しました。最後に、HFの潜在的な治療標的が8つ特定され、その中には4つのリスク因子(CYP11A1、GALT、KCNH2、METRN)と4つの保護因子(APOM、CHD4、IL11RA、LPAR5)が含まれます。GO濃縮、KEGG濃縮、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析では、これらの遺伝子が主に代謝調節および心臓電気生理学的プロセスに関与していることが示されました。さらに、薬物予測と分子ドッキングを用いて、ミトタン、アデル、ベンゾフラン、1,3-ジオトリルグアニジン、96-69-5、ブロモエノールラクトンなどの潜在的な薬剤が同定されました。さらに、PCR結果はミトタンが CYP11A1 および KCNH2と関連している可能性も示しました。これらの潜在的な治療標的に基づいて設計された薬剤は、より高い成功率を生み出し、臨床結果を改善する可能性があります。

概要

心不全(HF)は、心室充填や心筋の収縮力の障害によって定義される、心血管系で広く見られる疾患であり、その結果、代謝要求を満たす心拍出量が不足^します。臨床的には、肺および全身のうっ血、組織の低灌流、呼吸困難、疲労感、末梢浮腫などの症状が特徴です^1,4,5。治療法の進歩にもかかわらず、HFは世界的に多くの罹患率と死亡率の主要な原因であり、Global Burden of Disease(GBD)調査^6,7,8によれば6,400万人以上が影響を及ぼしています。重大な疾患負担は、新しい治療戦略の緊急性を強調しています。

現在のHFに対する薬理学的およびデバイスベースの介入は、最適でない有効性や副作用により制限されており、再入院率が持続的に高く、生活の質が低下しています 9,10,11,12。したがって、HFの病原性と因果関係を持つ新たな分子標的を特定することは、臨床転帰の改善に不可欠です。ゲノミクスを創薬に統合することは効率向上の非常に効果的な戦略であり、遺伝子検証済み治療法は臨床試験で有意に高い成功率を示しています 13,14,15。さらに、これらの実行可能な遺伝子によってコードされるタンパク質は、小分子抗体とモノクローナル抗体の両方の主要な治療標的として機能します^16,17。

ヒト遺伝学の最近の進展により、ゲノムワイド関連研究(GWAS)および発現定量形質遺伝子座(eQTL)データの統合解析を通じて、薬物標的の優先順位付けが可能になりました。メンデルランダム化(MR)は、遺伝的変異を因果効果を推定するための道具変数として活用し、観察研究に内在する交絡や逆因果を最小限に抑える^13,14。共局在およびサマリーベースMR(SMR)と組み合わせることで、このアプローチは疾患リスクに影響を与える可能性のある調節遺伝子の強固な優先順位付けが可能となり、標的発見のための遺伝的に固定された戦略^{を提供します。}従来の関連研究と比較して、MR、SMR、共局在を統合することで交絡や逆因果関係を克服し、強固な因果推論を確立します。さらに、このフレームワークは遺伝子発現と心不全リスクが同じ因果バリアントを共有することを保証することで、連鎖不平衡による偽陽性信号をフィルタリングし、標的優先順位付けを最適化します。心血管組織は特異性が高いものの、本研究は主に大規模な血液のcis-eQTLデータを用いて統計的検出力を最大化していることに注目に値します。このアプローチはHFに固有の組織特異的メカニズムを完全に捉えきれないかもしれませんが、血液由来の変異体はアクセス可能なバイオマーカーとして機能し、疾患の全身的遺伝的要因に関する確かな洞察を提供します。

本研究では、大規模なGWASおよびeQTLデータセットを用いて、薬剤化可能な遺伝子がHFリスクに与える因果関係を評価しました。共局在およびSMR解析を通じて有意な関連性がさらに検証されました。優先ターゲットの生物学的機能を明らかにするために、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析、さらにタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析が行われました。治療の可能性はその後、薬剤予測と分子ドッキングを通じて評価されました。最後に、選択された薬物生成遺伝子と候補薬物との関連性がin vitro 実験で検証されました。

結論として、本研究はHFの新たな治療標的発見に重要な洞察を提供します。MR、SMR、共局在解析、遺伝子豊富解析、PPIネットワーク構築、薬物予測、分子ドッキング、 in vitro 実験を用いることで、これらの発見はHFに対するより効果的な治療戦略の開発に寄与する可能性があります。

プロトコル

本研究で使用されるすべてのデータセットは、倫理的に承認された既存研究から取得されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 研究デザイン

この研究のワークフローは 図1に示されています。まず、薬物投与可能な遺伝子のシス-eQTLsから曝露データを得ました。次に、薬剤化可能な遺伝子とHFの因果関係を調査するためにMR解析を実施しました。その後、HFの治療対象候補は共局在解析およびSMR解析によって特定されました。その後、遺伝子豊か解析とPPIネットワーク構築が行われました。最後に、薬物予測と分子ドッキングを行い、薬物の遺伝子との親和性を探りました。

2. データソース

合計6,888個の薬剤化可能な遺伝子が2つの供給源から同定されました。あるデータセットには、複数の^{データソースを}統合した既に発表された研究から得られた4,463個の遺伝子が含まれていました。もう一方のデータセットには、薬物遺伝子相互作用データベース(DGIdb)からの5,012個の遺伝子が含まれていました²¹。詳細な情報はウェブサイト(https://www.dgidb.org/ 年)で示されています。重複を統合・除去した後、6,888個の独自の薬物可能な遺伝子が保持され、分析に用いられました。

Cis-eQTLデータはeQTLGen Consortium(https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html)から取得され、31,684件の血液サンプルの発現プロファイルと16,987件の遺伝子をカバー^{しています。}

HFの要約統計は、FinnGenデータベース²³のR12リリースから取得され、37,653件の症例と462,695件の対照群が含まれていました。HFの診断は国際疾病分類(ICD)に基づいており、ICD-10—I11.0、I13.0、I13.2、I50、ICD-9—4029B|428、ICD-8—42700|42710|428|7824が含まれていました。参加者全員がヨーロッパ系の血を引いていました。詳細はFinnGenのウェブサイトおよび原文記事(https://www.finngen.fi/en/access_results)でご覧いただけます。

3. メンデルランダム化解析

計測変数(IV)は、3つの主要なMR仮定に基づいて選択^{されました。}まず、IVは曝露因子と直接関連しています。第二に、IVは交絡因子とは関連していません。最後に、IVは曝露によってのみ結果に影響を与えます。近位eQTLは標的遺伝子に対してより即時かつ強固な制御を行うため、MRは生物学的近接性を最大化するために遺伝子の100 kb領域内に位置するSNPのみを使用しました。SNP選出には厳格な基準が適用されました。選択されたすべてのSNPは、各薬剤可能遺伝子の転写開始部位の上流100 kbおよび転写末端部位の下流100 kb以内に位置していました。ゲノム全体に有意なSNP(p < 5×^10-8)のみが含まれ、²⁵件が含まれました。連鎖不平衡(LD)を最小化するため、^r2 閾値を0.001、凝集距離を10,000 kb²⁶でLD凝集を行いました。F統計量>10のSNPは保持され、次の式で計算されました:F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]^]27。SNPの情報は 補足表1に記載されています。

主な解析手法は逆分散加重(IVW)およびWald比率でした。p値が0.05未満の場合は統計的に有意とみなされ、^28,29。偽発見率(FDR)を適用してp値を調整し、偽陽^{性の結果を}最小化しました。SNPが1つしかない場合はWald比法が用いられました。それ以外の場合はIVWが適用されました。分析にはMR-Egger、加重中央値、加重モード、十分なSNPが存在する単純モードが含まれていました。

コクランQ検定とMR-Egger切片解析を用いて異質性と多面性を検証しました。Q-p値が0.05を超えると異質性が欠如したことを示す³¹。MR-Egger切片の p値は0.05未満で、方向性多面性¹⁸の存在を示しました。最後に、単一のSNPによって結果が影響を受けるかどうかを検証するために「リーブ・ワン・アウト」テストが実施されました。MR解析はR(バージョン4.4.2)のTwoSampleMRパッケージ(バージョン0.6.11)を使用して実施されました。

4. 共局在解析

coloc Rパッケージ(バージョン6.0.1)を用いて共局在解析を行い、共有遺伝子変異が遺伝子発現およびHFリスクの両方に影響を与えるかどうかを明らかにしました³²。SNPがいずれかの形質と関連している確率は、それぞれ1×^10-4 、1×^10-5に設定されました。5つの仮説の事後確率は次のように計算できます:(1) PPH0:SNPは2つの形質と関連していません。(2) PPH1/PPH2:SNPは遺伝子発現またはHFに関連しています。(3) PPH3:SNPはHFおよび遺伝子発現と関連していますが、異なるSNPによって駆動されます。(4) PPH4:SNPはHFおよび遺伝子発現と関連しており、共通のSNPによって駆動されます。PPH4>0.8は共局在の証拠とみなされました。

5. SMR解析

SMR解析は、SMRソフトウェア(バージョン1.3.1)を用いて遺伝子とHFの関係を探るために実施されました。³³。依存機器における異質性(HEIDI)検定は、観察された関連が連鎖によるものかどうかを判断するために実施されました。有意なSMR p値(< 0.05)とHEIDI p値>0.05を組み合わせた場合、連鎖シナリオによる関連ではなく、真の因果関係を支持する証拠と解釈されました。詳細な運用プロトコルや計算設定は公式ウェブサイトで確認できます。

6. 濃縮分析

GOおよびKEGG濃縮解析を用いて、スクリーニングされた潜在的な治療対象遺伝子の生物学的機能と経路を特徴づけました³⁴。GO濃縮には生物学的プロセス(BP)、分子機能(MF)、細胞成分(CC)が含まれます。RパッケージclusterProfiler(バージョン4.14.6)とPathview(バージョン1.46.0)がエンリッチメント解析^35,36に使用されました。

7. 候補薬剤予測

潜在的な治療化合物を特定するために、薬剤シグネチャーデータベース(DSigDB)(http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷を用いて薬剤予測解析が行われました。DSigDBには22,527の遺伝子セットが含まれており、そのうち19,531個の遺伝子をカバーする17,389のユニークな化合物が含まれています。候補遺伝子と化合物間の関連を解析し、その後、HF関連遺伝子を標的とする潜在的に関連性の高い薬剤を特定するために濃縮解析が行われました。

8. タンパク質相互作用ネットワークの構築

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークはGeneMANIA(https://genem ania.org/)³⁸を用いて構築されました。GeneMANIAは遺伝子機能仮説の生成、遺伝子リストの解析、機能検査のための遺伝子の優先順位付けを支援できます。

9. 分子ドッキング

分子ドッキングは、遺伝子の薬剤性およびそれらが薬剤候補とどのように関係しているかを検証するために行われました。ドッキングシミュレーションは、化合物と標的タンパク質間の結合親和性や相互作用パターンを評価し、候補の優先順位付けや最適化に役立ちます。タンパク質構造はProtein Data Bank(PDB)(http://www.rcsb.org/)から取得し、化合物構造はPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹から取得しました。ドッキングはCB-Dock2(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php)を使用して行われ、キャビティ検出を用いてブラインドドッキング^40,41を誘導します。詳細な操作手順や計算設定の情報は公式ウェブサイトで入手可能でした。

10. 細胞培養

ヒト不死化心筋細胞(AC16)をAC16細胞特異的培養培地で無菌状態で培養しました。細胞は5%のCO2を含む加湿インキュベーターで37°Cで維持されました。培養培地は2〜3日ごとに交換され、細胞は約70%〜80%の合流率で通過して最適な成長条件を維持しました。細胞の形態と融合は、各実験前に光顕微鏡を用いて定期的にモニタリングされました。すべての細胞培養手順は、汚染リスクを最小限に抑えるため、バイオセーフティキャビネット内で実施されました。処理実験では、AC16細胞を6ウェルプレートにシードし、処理投与前に一晩付着させました。

11. 定量逆転写PCR(RT-PCR)

AC16細胞は、約60%〜70%のコンフルエンスに達した後、200μMパルミチン酸(PA)または20μMミトタンで24時間処理されました。PAは牛血清アルブミン(BSA)に溶解し、ミトタンはジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解しました。すべての潜在的に危険な試薬は、標準的な実験室安全手順に従い、手袋や実験用コートなどの適切な個人用防護具を使用して取り扱われました。

処理後、製造元の指示に従いRNaseフリー条件下でRNA抽出キットを用いて総RNAを抽出しました。RNA抽出の手順は可能な限り氷上で行われ、RNA分解を最小限に抑えました。RNA濃度と純度は下流実験前に評価され、A260/A280比が1.8から2.0のサンプルのみが後続解析に使用されました。

補完的DNA(cDNA)は、製造元のプロトコルに従い逆転写キットを用いて合成されました。その後、リアルタイムPCR検出システム上でSYBR Green Master Mixを用いて定量的なRT-PCRが実施されました。各反応は最終体積10μLで、5μLのSYBRグリーンマスターミックス、0.4μLの前方プライマー、0.4μLの逆プライマー、1μLのcDNAテンプレート、3.2μLのヌクレアーゼフリー水を含んでいました。増幅は以下のサイクル条件下で行われました:95°Cで初期変性30秒、その後95°Cで40サイクル変性5秒、60°Cでアニーリング/延長30秒。各実験は3回の生物学的複製で行われ、すべての反応は三重に行われました。

GAPDH を内部参照遺伝子として用い、 CYP11A1 および KCNH2 の相対mRNA発現レベルは2^−ΔΔCt 法を用いて算出しました。溶融曲線解析における単一のピークは特定の増幅を示すと考えられました。RT-PCRに使用されるプライマー配列は 補足表2に記載されています。

結果

メンデルランダム化
薬剤化可能な遺伝子発現とHFの因果関係を評価するMR結果は補 足表3に示されています。FDR調整後のP値が0.05未満の場合は統計的に有意とされました。HFと有意な因果関係を持つ遺伝子は合計11個同定されました(図2)。そのうち6つの遺伝子がHFリスク増加と関連しており、 CDKN1A (P_FDR:0.03、OR:1.293)、 CYP11A1 (P_FDR:0.034、OR:1.494)、 GALT (P_FDR:0.042、OR:1.074)、 KCNH2 (P_FDR:0.018、OR:1.163)、 LST1 (P_FDR:0.03、OR:1.112)、 METRN (P_FDR:0.018、OR:1.115)が含まれます。残りの5つの遺伝子はHFリスクの低下と関連しており、 APOM

ディスカッション

本研究では、MRを用いて薬剤化可能な遺伝子がHFリスクに与える因果関係を体系的に評価し、8つの潜在的な治療標的を特定しました。これには4つの保護因子(APOM、CHD4、IL11RA、LPAR5)および4つのリスク因子(CYP11A1、GALT、KCNH2、METRN)が含まれていました。これらの関連は、共局在解析やSMRによってさらに支持されました。GO、KEGG濃縮、PPIネットワーク解析による機能的注釈により、これらの遺伝子は主に代謝や電気生理に関連する経路を通じてHFに影響を与える可能性が示唆されました。さらに、薬物予測や分子ドッキング研究は、これらの標的の翻訳の可能性を強調しました。

APOMはHFの保護因子として特定されました。APOMはスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)と結合し、TNF-αの発現を減少させ、単球-内皮の癒着を制限し、内皮バリアの完全性を維持することで抗炎症効果を発揮し、炎症誘発性心筋損傷を軽減します 42,43,44

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 細胞特異的培養液	HyCyte	TCH-G119
cDNA リバース キット	Abclonal	RK20400
CFX96™ Real-Time システム	Bio-Rad Laboratories
ミトタン	TargetMol	T1199
パルミチン酸	TargetMol	T2908
RNA 抽出キット	Abclonal	RK30120