LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

サマリー

LNNa-タンパク質の直接的な相互作用を特定するためのUVベースのChIRP法。

要約

長く非コードRNA(lncRNA)は、多様な生物学的プロセスを調節する重要な要因として浮上しています。しかし、ほとんどのlncRNAの機能の分子メカニズムは依然として十分に解明されていません。特にRNA結合タンパク質(RBP)などの相互作用タンパク質の同定は、lncRNAの機能を解明する重要な戦略です。利用可能な手法の中では、RNA結合タンパク質(ChIRP)の包括的な同定と質量分析法が、その単純なプローブ設計と簡単なワークフローから広く利用されています。従来のChIRPはパラホルマルデヒド(PFA)架橋に依存しており、これは直接的なRNA-タンパク質接触とブリッジング因子による間接相互作用の両方を捉えます。これに対し、UV架橋と厳格な洗浄条件の組み合わせは、直接的なRNA-タンパク質相互作用を優先的に保持します。lncRNA Tug1 をモデルとして、培養細胞のChIRP枠組み内でUV架橋とPFA架橋を比較し、UVベースのChIRPが直接的なlncRNA-タンパク質相互作用で濃縮することが示されました。このUVベースのワークフローはその後マウス精巣にも拡張され、組織を単細胞懸濁液に解離してUV架橋を行うことで、 Tug1結合タンパク質をネイティブ組織の文脈で同定できるようになりました。細胞株由来のインタラクトームとの比較により、共有型および組織特異的相互作用者が明らかになりました。2つの共通の直接相互作用は、強化架橋免疫沈殿(eCLIP)によって独立して検証されました。このUVベースのChIRPアプローチはcPDiRT(RNAターゲットと直接相互作用するタンパク質を捕捉する方法)と呼ばれます。これらを組み合わせることで、培養細胞および自然組織の両方におけるlncRNA結合タンパク質の同定が可能になります。組織解離とUV架橋の組み合わせは、多様な臓器系における直接的なlncRNA-タンパク質相互作用を研究するための広範な応用戦略を提供します。

概要

最近のハイスループットトランスクリプトミクス研究では、クロマチンの組織から細胞シ^{グナル伝達}に至るまで多様な生物学的プロセスに関与する数千の長非コードRNA(lncRNA)が明らかになりました^1,2。広範な発現と機能的重要性にもかかわらず、ほとんどのlncRNAの分子メカニズムは依然として不十分に定義されていません。主な障害は、特にRNA結合タンパク質(RBP^)を中心とした物理的タンパク質パートナーの特定です^3,4,5。

現在のRNA中心法は主に化学架橋に依存しており、直接的および間接的なRNA-タンパク質相互作用の両方を捉えます。その結果、これらの手法は、正真正銘の直接接触を特定するよりも、グローバルなインタラクソームマッピングに適^{しています。}RNA結合タンパク質の包括的な同定と質量分析(ChIRP-MS)は、その単純なプローブ設計と効率的なワークフローにより、lncRNA-RBP相互作用のマッピングに広く用いられている技術^です。従来のChIRP-MSはパラホルムアルデヒド(PFA)架橋を用いており、これは直接的なRNA-タンパク質接触と^{ブリッジング因子}による間接結合の両方を捉^えます。

これに対し、254 nmのUV架橋は重要な利点を提供します。RNAとタンパク質がほぼゼロの距離(通常<1 Å)に接触している場合にのみ共有結合します¹¹。このプロセスは水素結合を安定した共有結合に変換し、非共有結合の間接相互作用者を除去する厳格な高塩洗浄条件を可能にします。したがって、UVベースのアプローチは化学架橋法よりも直接的なRNA-タンパク質相互作用に対してより高い特異性を提供します^12,13。それにもかかわらず、組織由来のlncRNA相互作用研究では、架橋効率や紫外線浸透の制限に関する懸念から、UVベースのアプローチは依然として十分に活用されていません。

生理学的に関連性の高い文脈でlncRNAとタンパク質の直接的な相互作用を調査するために、lncRNA Tug1 がモデルシステムとして選ばれました。 Tug1 は、その深刻なノックアウト表現型と精巣内での高い濃縮性により、組織互換性の直接相互作用ワークフローを検証する理想的なベンチマークとなります。 Tug1 の遺伝子切除は完全な男性不妊、精子形成の障害、精子形態の異常を引き起こす¹⁴。さらに、 Tug1 は高脂肪食マウスにおけるセルトリ細胞の機能と血液精巣の完全性を支持します¹⁵。これらのよく確立された表現型にもかかわらず、精巣で Tug1 機能を媒介する直接的なタンパク質パートナーは不明です。精巣は最近実験的に¹⁶のRBPを発現する器官です。この知識のギャップは、ほとんどのlncRNA-タンパク質相互作用マッピング手法が培養細胞系向けに開発されていることを主に反映しています。

この制限に対処するため、ChIRPフレームワークはPFA架橋をUV架橋に置き換え、 Tug1と直接相互作用するタンパク質を捕捉する形で修正されました。候補相互作用は、強化架橋免疫沈殿法と深層シーケンシング(eCLIP-seq)を用いて独立して検証されました¹⁷。このワークフローはさらに組織応用にも拡張され、UV架橋の前に新鮮なマウスの精巣組織を単一細胞に解離しました。この最適化されたアプローチはcPDiRT(RNAターゲットと直接相互作用するタンパク質の捕捉)と呼ばれました。

マウス精巣の Tug1 にcPDiRTを適用することで、ネイティブ組織の文脈で直接相互作用マッピングが可能になりました。培養細胞での並行実験により、PFAベースの相互作用プロファイルとUVベースの相互作用プロファイルを並べて比較しました。独立したeCLIP検証と組み合わせることで、このアプローチは精子形成時に Tug1 の機能に寄与する可能性のある高信頼性の分子パートナーセットを生成しました。ここで提示されたプロトコルは、培養細胞およびネイティブ組織の両方で標的lncRNAと直接相互作用するタンパク質の捕捉を可能にします。精巣における Tug1 の直接的な相互作用を定義することで、この方法は生殖に不可欠なlncRNAの機構的研究を進展させ、生殖組織やその他の複雑組織におけるlncRNA-タンパク質相互作用の一般化可能な研究プラットフォームを提供します。

プロトコル

すべての溶液は、ヌクレアーゼフリー・プロテアーゼフリーの超純水と試薬を用いて調製されました。すべての試薬および機器は 材料表に記載されています。

すべての動物実験は南京医科大学動物倫理委員会(承認番号:IACUC-1812003-4)によって承認され、実験 動物のケアと利用に関する指針 (国家研究会議第8版)に従って実施されました。オスのC57BL/6匹マウス(生後4週間)は、12時間の光と12時間の暗いサイクルで飼育し、自由に餌と水を得てください。統計的有意性を達成するために必要な動物数を最小限に抑え、動物の苦しみを最小限に抑える。承認された機関プロトコルに従い、CO₂吸入後に子宮頸部脱臼を行ってマウスを安楽死させてください。

1. バッファーの準備

1. 細胞溶解バッファーの準備
   1. 50 mM トリスHCl(pH 7.0)、10 mM EDTA、1% SDSを含む細胞溶解バッファーを準備します。
   2. 使用直前に1 mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル、特殊なRNase阻害剤を加えます。
      注意: SDSは皮膚や目の刺激物です。ほこりやエアロゾルの吸入は避けてください。PMSFは非常に毒性が高く、コリンエステラーゼ阻害剤として働き、水溶液中では不安定です。使用直前にPMSFを準備してください。これらの試薬を扱う際は手袋と安全メガネを着用してください。PMSFは化学換気フードで扱いましょう。
2. ハイブリダイゼーションバッファーを準備する
   1. 750 mM NaCl、1% SDS、50 mM Tris-HCl(pH 7.0)、1 mM EDTA、15% ホルマミドを含むハイブリダイゼーションバッファーを準備します。
   2. 使用直前に1 mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル、特殊なRNase阻害剤を加えます。
      注: ホルマミドは光から守り、4°Cで保存します。
      注意: ホルマミドは催奇形原および生殖の危険があります。ホルマミドは手袋、白衣、安全メガネを着用し、化学煙幕のフード内で取り扱いましょう。吸入や皮膚接触は避けてください。
3. ウォッシュバッファーを準備してください
   1. 50 mM トリスHCl(pH 7.0)、1 M NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS、0.5% デオキシコール酸ナトリウムを含む洗浄バッファーを準備します。
   2. 保管中はウォッシュバッファーを光から守りましょう。
4. プロテイナーゼK(PK)バッファーを準備します
   1. 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl(pH 7.0)、1 mM EDTA、0.5% SDS を含むPKバッファーを準備します。
   2. 使用直前に最終濃度5%にプロテナーゼKを加えてください。

2. プローブの設計と準備

1. アンチセンスプローブの設計
   1. singlemoleculefish.com¹⁸で利用可能なオンラインプローブデザイナーを使ってアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを設計します。
2. ビオチニル化プローブを取得する
   1. 3'-BiotinTEG修飾を含むアンチセンスDNAプローブを注文してください。
3. プローブプールの準備を
   1. 各プローブを個別に100μMに希釈します。
   2. すべてのプローブを等量に混ぜてプローブプールを作ります。最終的な複合オリゴヌクレオチド濃度を100μM維持します。
   3. プローブプールは-20°Cで保存してください。
      注: 推奨されるプローブ設計パラメータは以下の通りです:(i) ターゲットRNAの100 bpあたり1本のプローブ、(ii) ターゲットGC含有量45%、(iii) プローブ長20 nt、(iv) プローブ間の間隔60〜80 nt。
      注: RNAがプローブ設計者が許容するサイズ制限を超える場合は、設計前に配列をより小さなセグメントに分割します。繰り返し領域や広範な配列相同性を持つ領域を除外する。

3. 細胞採取、組織解離、UV架橋の実施

1. UVなしの対策を準備してください
   1. 対照試料と実験試料を並行して準備します。
   2. 対照試料からUV架橋のステップは省略してください。
   3. 超音波検査、RNA-タンパク質プルダウン、RNA抽出、タンパク質抽出を含むすべての後続手順を両グループで同一に実施します。
      注: UVなしコントロールを使って、UV依存的なRNA-タンパク質相互作用と非特異的な背景結合を区別します。
2. 細胞を収穫し、UV架橋を行う
   1. ウォッシュ培養細胞
      1. 残留培養培地を除去するためにPBSで細胞を3回洗浄します。
   2. 架橋細胞
      1. 3 mLのPBSを15cmの培養皿に均等に分散します。
      2. 254nmのUV架橋剤で細胞を照射し、4000 mJ^/cm²の線量で照射します。
   3. 架橋セルを収集する
      1. 架橋後にPBSで細胞を収集します。
      2. 懸濁液を遠心分離し、上清液を捨てます。
      3. ペレットの重量を量り、サンプルあたり最低500 mgの質量を確認してください。
3. 精巣組織を解離し、UV架橋を行います
   1. 精巣の準備をする
      1. 精巣のカプセルを剥離してください。
      2. 組織をDMEMで2回洗ってください。
   2. コラーゲナーゼ消化を行う
      1. DMEMに1 mg/mLのコラーゲン剤IVを含む組織を37°Cで5〜15分間培養します。
      2. 精細管が放出されるまで消化を続けます。
         注: 消化時間は15分を超えないようにしてください。
   3. 精細管を洗い流す
      1. 1000 × gで4°Cで1分間、サスペンションを遠心分離します。
      2. 上清液を取り除きます。
      3. ペレットは5〜10 mLのDMEMで洗浄します。
      4. 同じ条件下で再び遠心分離機を操作しました。
   4. トリプシン消化を行う
      1. ペレットを1 mg/mL DNase Iを含む0.25%トリプシンに再懸濁させます。
      2. 37°Cで5〜15分間培養します。
         注: 消化時間は15分を超えないようにしてください。
   5. 酵素による消化を止めます
      1. 同じ量のDMEMに加え、10%のFBSを補足します。
   6. 単一セル懸濁液を生成する
      1. 懸濁液を70μmのセルストレーナーでろ過します。
   7. ウォッシュセル
      1. 遠心分離機セルは 2000 × g で4°Cで5分間使用します。
      2. 上清液は捨てる。
      3. ペレットを5〜10 mLのPBSで洗浄します。
      4. 同じ条件下で再び遠心分離機を操作しました。
   8. 架橋精巣細胞
      1. PBSの単一セル懸濁液を再懸濁してください。
      2. 懸液を15cmの培養皿に均等に分散させます。
      3. 254nmのUV架橋剤で細胞を照射し、4000 mJ^/cm²の線量で照射します。
   9. 架橋セルを収集する
      1. 紫外線なしの制御では、照射を省略してください。
      2. PBSで細胞を集めましょう。
      3. 懸濁液を遠心分離し、上清液を捨てます。
      4. ペレットの重量を量り、サンプルあたり最低500 mgの質量を確認してください。
         注: 約500mgの細胞ペレットを得るために必要なマウスの数は、年齢と組織収量によって異なります。本研究では約10〜12匹の生後4週間のマウスが使用されました。

4. 超音波処理を行う

1. 溶解液の準備
   1. 細胞ペレットを細胞溶解バッファーに100 mg ペレット/1 mLバッファーの比率で再懸浮させます。
   2. 均一な懸濁液を得るためによく混ぜます。
2. ソニックカットサンプル
   1. ソニックエイトは水浴ソニックケーターまたは集中超音波装置を用いて溶解します。
   2. 分解液が視覚的にクリアになるまで超音波検査を続けます。
      注: アガロースゲル電気泳動によるDNA断片化の検証。ほとんどのDNA断片が1 kbから2 kbの間になるまで超音波処理を続けます。

5. RNAタンパク質プルダウンを行う

1. 入力サンプルを収集する
   1. 入力制御のために溶解液のアリコットを除去してください。
   2. RNA解析用に約10μL、タンパク質解析用に約10μLを予約してください。
   3. ハイブリッド化および洗浄手順中は、入力サンプルを37°Cに保ちます。
2. プリクリア溶解液
   1. 各サンプルに30μLのあらかじめ洗浄済み磁気ビーズを加えます。
   2. 37°Cで30分間、ハイブリッドオーブンで優しく混ざり合いながら培養します。
      注: 磁気ビーズは使用前に洗ってください。ビーズのアリコートを磁気スタンドに1分間置くか、溶液が透明になるまで待つ。保存液を完全に取り除く。ビーズを500μLの細胞溶解バッファーで2回洗います。
3. プリクリアリングビーズを外す
   1. サンプルを磁気スタンドに置きます。
   2. 上澄液を新しいチューブに移します。
   3. 残留ビーズを完全に除去するために、この移動を一度繰り返します。
4. ハイブリダイズプローブ
   1. 各サンプルに2つのハイブリダイゼーションバッファーを加えます。
   2. 100μMプローブストック1 μLに対し、溶解液1 mLの比率でプローブを追加します(補足表1)。
5. インキュベート交配反応
   1. 37°Cでハイブリダイゼーションオーブンで12〜16時間、端から端まで回転させて培養します。
6. キャプチャービーズを準備してください
   1. ハイブリダイゼーション終了直前に、100μLの磁気ビーズを細胞溶解バッファーで3回洗浄します。
   2. 最終洗浄後は残留バッファーをすべて取り除きます。
7. プローブバウンド複体の捕獲
   1. 遠心分離機のハイブリッド化反応。
   2. 洗浄したビーズを1mLのハイブリッドサンプルに再懸浮させます。
8. ビーズに複合体を結合させる
   1. ビーズサスペンションを元のチューブに戻してください。
   2. 37°Cで30〜40分間混ぜて培養します。
9. ビーズを回収する
   1. 遠心分離機のサンプルを短く。
   2. チューブを磁気スタンドに1〜2分間置くか、溶液が透明になるまで待つ。
   3. 上清液は捨てる。
   4. ピペットの先端で残留液を除去します。
      注: 液体除去時に磁気ビーズペレットを乱さないようにしてください。
10. ウォッシュが占領した複合体
    1. 洗浄バッファー1mLを加えます。
    2. ビーズは37°Cで洗い、5分間連続で混ざり合います。
    3. 洗車手順を5回繰り返します。
       注: ウォッシュバッファーには1 M NaClが含まれており、非共有結合タンパク質-タンパク質およびタンパク質-RNA相互作用を破壊しつつ、共有結合UV誘導架橋を保持します。これらの厳格な条件により、間接的な相互作用者や非特異的な背景が除去され、直接的なタンパク質パートナーが濃縮されます¹⁹。
11. RNA分析のための予備物質
    1. 洗浄したビーズの1%〜10%を新しいチューブに移し、RNA分析を行います。
    2. 残りのビーズはすぐにタンパク質抽出に使うか、-80°Cで保存してください。
       注: 必要ならここでプロトコルを一時停止してください。ビーズサンプルはタンパク質抽出まで-80°Cで保存します。
12. 溶出タンパク質
    1. ビーズにSDSサンプルバッファを追加してください。
    2. サンプルを95°Cで30分間煮沸し、タンパク質を溶出し逆架橋を形成します。
    3. 質量分析に進め。

6. RNAを抽出する

1. タンパク質を消化する
   1. ビーズ結合RNAサンプルを100μLのPKバッファーに再懸浮します。
   2. PKバッファーを使用してRNA入力サンプルを最終体積100μLに調整します。
2. プロテイナーゼKと共にインキュベート
   1. サンプルを50°Cで45分間連続混合しながら培養します。
3. 不活性化プロテイナーゼK
   1. 95°Cで10分間サンプルを加熱します。
4. TRIzol試薬を加える
   1. 各サンプルに500μLのトリゾル試薬を加えます。
   2. ボルテックスを徹底的に。
   3. 室温で5分間孵育します。
      注意: トリゾル試薬にはフェノールとグアニジンチオシアネートが含まれています。試薬は手袋、白衣、安全メガネを着用し、化学煙幕のフードで扱いましょう。吸入や皮膚接触は避けてください。肌が触れた場合は、すぐに石鹸と水で洗ってください。
5. 位相分離を行う
   1. 各サンプルに100μLのクロロホルムを加えます。
   2. ボルテックスを徹底的に。
   3. 室温で5分間孵育します。
6. 水相を回復する
   1. 遠心分離機で4°Cで15分間サンプルを取る。
   2. 上部水相を新しいチューブに移します。
7. RNAを精製カラムに結合させる
   1. 水相に100%エタノールを等量に加えます。
   2. よく混ぜてください。
   3. RNA精製カラムにサンプルを積み込みます。
8. RNAを精製する
   1. メーカーの指示に従ってRNAのクリーンアップを行いましょう。
   2. 30μLのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出すること。
9. qRT-PCRによるRNA濃縮の検証
   1. 定量逆転写PCR(qRT-PCR)には、1回の反応ごとに1μLの溶出RNAを使用します。
   2. 対照群と比較して標的RNAの濃縮を評価します。

7. LC-MS/MS解析の実施

1. SDS-PAGEによる分離タンパク質
   1. ステップ5.12で得られたタンパク質を4×LDSサンプルバッファーと混合します。
   2. タンパク質を4%〜12%のBis-Trisゲルに分離します。
   3. 銀色のステインキットでジェルを染めます。
   4. タンパク質レーン全体を一つのバンドとして切除します。
2. 酒税ゲルの部品
   1. 清潔なメスでタンパク質バンドを切除します。
   2. 余分なジェルの量を最小限に抑えましょう。
   3. ジェルを約1 mm、³ 個に切ってください。
   4. ゲル片を0.5mLのチューブに移します。
3. デステインゲルピース
   1. 染色液100μLを加えます。
   2. 10分間のボルテックス。
   3. 遠心分離機は14,000 × g で1分間。
   4. 上清液を取り除きます。
   5. この染色手順を繰り返し、ゲル片が透明になるまで繰り返します。
4. タンパク質を還元する
   1. 還元液100μLを加えます。
   2. 56°Cで30分間孵化します。
   3. サンプルを室温まで冷やします。
   4. 短時間遠心分離機で上澄液を除去します。
5. アルキル酸タンパク質
   1. アルキル化溶液100μLを加えます。
   2. 暗闇の中、室温で20分間孵化させます。
   3. 上清液を取り除きます。
   4. ジェルを100μLの消化バッファーで5分間洗います。
6. タンパク質を消化する
   1. ジェルのかけらを完全に覆うのに十分なトリプシン溶液を加えます。
   2. 37°Cで16〜18時間培養します。
7. 抽出ペプチド
   1. 抽出液30μLを加えます。
   2. ソニックエイトは15分、ボルテックスは30分です。
   3. 遠心分離機は14,000 × g で1分間。
   4. 上澄液を新しいチューブに移します。
   5. 抜き出しの手順を2回繰り返してください。
   6. すべての抽出物をプールしてください。
   7. 抽出抽出物を真空濃縮器で約1時間乾燥させます。
8. StageTipを使ってペプチドをクリーン化する方法
   1. 乾燥ペプチドを0.1%の蟻酸(FA)20μLに再懸濁します。
   2. サンプルをC18ステージチップに積み込みます。
   3. 遠心分離機は1,000 gで2分間 × 。
   4. ステージチップは0.1%のFA入り20μLで洗います。
   5. 60%アセトニトリル/0.1%FAを20μLでLC-MSバイアルに溶出します。
   6. ユーレートを乾かします。
   7. 0.1%のファルタリを含んだ10μLのペプチドを再懸濁します。
      注: 必要ならここでプロトコルを一時停止してください。精製ペプチドはLC-MS/MS分析前に-80°Cで保存します。
9. LC-MS/MSデータを取得
   1. 0.1%の蟻酸でペプチドを再構成します。
   2. 75μm×250mmのC18分析カラム上で、流量300 nL/minでペプチドを分離します。
   3. 以下の溶媒B勾配(アセトニトリル中の0.1%の蟻酸)を適用します:
      0〜40分の間で2%〜25% B
      40〜48分の25%–40% B。
      50〜57分の40%–99% B
      99%のBを3分間キープします
   4. 質量分析計をデータ依存取得モードで操作してください。
   5. 350〜1200m/z範囲で70,000の解像度でフルスキャンMSスペクトルを取得します。
   6. 17,500解像度で15件の連続高エネルギー衝突解離(HCD)MS/MSスキャンを取得。
   7. スキャンごとに1回のマイクロスキャンを記録してください。
   8. 動的除外を30秒に設定してください。
10. プロセス質量分析データ
    1. 生データをMaxQuant(v2.1.0.0)で処理します。
    2. UniProtからダウンロードしたマウスのタンパク質配列と比べてスペクトル検索。
    3. 消化酵素としてトリプシンを指定してください。
    4. 最大2回の切り谷間を外すことを許容してください。
    5. メチオニン酸化を可変修飾として指定してください。
    6. システインカルバミドメチル化を固定修飾として指定します。
    7. 前駆体と断片質量許容度をそれぞれ15 ppmと20 ppmに設定します。
    8. ペプチドおよびタンパク質レベルの両方で偽発見率を1%に抑えることができます。
    9. iBAQベースのラベルフリー定量を用いてタンパク質の存在比を推定します。

8. 遺伝子オントロジーのエンリッチ解析を行う

1. 機能豊化の解析
   1. clusterProfiler Rパッケージ(v4.6.0)を使用してGene Ontology(GO)エンリッチメント解析を行います。
   2. 参照注釈ソースとしてGOデータベース(v2024-09-20)を使用してください。
   3. 複数検査に対してベンジャミニ・ホッホバーグ補正を適用します。
   4. 統計的有意性を調整済みP値(FDR)<0.05と定義します。

9. eCLIP-seq検証を行う

1. eCLIPサンプルの準備
   1. 前述の強化架橋免疫沈降(eCLIP)を行う¹⁷。
   2. PABPC1およびCCT3の免疫沈殿用にUV架橋細胞サンプルを準備します。
   3. eCLIP解析バッファーを使用した溶合サンプル。
2. 免疫沈殿RNA-タンパク質複合体
   1. 各サンプルに10μgの抗体を加えます。
   2. 磁気ビーズ上のRNA-タンパク質複合体を捕獲します。
   3. 免疫沈殿前に入力サンプルを採取してください。
3. RNAライブラリーの準備
   1. タンパク質結合RNAの脱リン酸化。
   2. 3フィートのRNAアダプターを回収RNAに結紮します。
   3. 免疫沈殿および入力サンプルを厳しい条件下で洗浄します。
   4. ビーズを煮沸して融出します。
   5. サンプルは4%–12%のBis-Tris勾配ゲルで分解します。
   6. 分離した複合体をニトロセルロース膜に移します。
4. RNAを回収する
   1. サイズが合った膜領域を切除します。
   2. 尿素とプロテイナーゼKを使ってタンパク質を消化します。
   3. 膜からRNAを回収する。
5. シーケンスライブラリの生成
   1. 逆転写によりRNAがcDNAに回復されました。
   2. エクソヌクレアーゼIとエビアルカリホスファターゼ混合液を用いてcDNAを精製します。
   3. T4 RNAリガーゼを使ってDNAアダプターをcDNAの3'端に結合します。
   4. 高忠実度DNAポリメラーゼを用いてライブラリーを増幅します。
   5. 3%の低融点アガロースゲル上に別々の増幅ライブラリーを設置しました。
   6. ゲル抽出キットを用いてサイズ選択ライブラリを精製します。
   7. Illuminaプラットフォーム上のシーケンスライブラリ。
6. eCLIP-seqデータの解析
   1. ENCODE eCLIPパイプライン²⁰を使ってシーケンスデータを解析します。
   2. トリムアダプターと3フィートアダプターダイマーはcutadapt(v1.14)を使用しています。
   3. STAR(v2.7.6a)を用いてUCSCの繰り返し要素にアラインを読みます。
   4. 繰り返し要素へのリードマッピングを削除してください。
   5. 残りのリードをmm10参照ゲノム(GENCODE vM23)にアライメントします。
   6. PCR重複を除去してください。
   7. CLIPPERを用いて濃縮結合部位を特定します。
   8. 有意なピークとは、フォールド濃縮が8≥、調整後のP≤0.001と定義します。
   9. 再現性のない発見率(IDR)閾値0.01を用いて再現可能なピークを特定します。

結果

Tug1結合タンパク質を特定するために、UV架橋をChIRPのワークフローに組み込み、cPDiRTと呼ばれる方法(図1)を確立しました。従来のChIRPは、Tug1相互作用タンパク質を濃縮するためにGC2細胞で初めて実施されました(図2A、B)。質量分析により、陰の対照群に対して190以上の濃縮タンパク質が確認されました(図2C;補足表2)。これに対し、最適化されたUV線量4000 mJ/^cm²で実施されたcPDiRT-MSは、より選択的なタンパク質群を同定しました(図2C;補足表2)では、その3分の2以上が従来のChIRP-MSで検出されたものと重複していました(

ディスカッション

cPDiRTは、パラボルマルデヒド(PFA)架橋をUV架橋に置き換え、直接的なlncRNAとタンパク質の相互作用を選択的に捕捉する改良されたChIRPベースのプロトコルとして開発されました。新鮮な精巣組織を単一細胞に酵素解離させ、紫外線架橋を組み合わせることで、培養細胞株から自然組織への直接相互作用マッピングが拡張されました。培養細胞での並行実験により、PFAベースとUVベースのアプローチを並べて比較でき、UV由来の相互作用はeCLIP-seqによって独立して検証されました。これらの結果は、UV架橋が組織由来サンプルのChIRPワークフローに高い特異性を維持しながら成功裏に統合できることを示しています。

組織の浸透、分子間架橋アーチファクト、間接的な関連による背景の上昇などの課題があるため、ChIRPのようなPFAベースのRNA中心アプローチを組織サンプルに適用した研究はほとんどありません。これらの制限により、組織ベースのLNCNAインターラクトームマッピングの広範な応用が制限され、組織レベル研究のより特異的な代替...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	組織の解離と単一細胞懸濁液の調製用
100% エタノール	Sigma-Aldrich	459844	RNAのクリーンアップ用
AffinityScript リバース トランスクリプターゼ	Agilent	600107	eCLIP cDNA合成用
Anti-CCT3 抗体	Abcam	Ab225878	eCLIP用抗体
Anti-PABPC1 抗体	Abcam	Ab312314	eCLIP用抗体
クロロホルム	Sigma-Aldrich	C2432	RNA抽出用
コラーゲナーゼ タイプ IV	Sigma-Aldrich	C5138	精巣組織の酵素分解用
脱リン酸化試薬（T4 PNK）	New England Biolabs	M0201S	eCLIP RNAの脱リン酸化用
DMEM 高グルコース培地	Gibco	11965092	細胞培養および組織解離バッファー用
Dynabeads MyOne ストレプタビジン C1 磁性ビーズ	Thermo Fisher Scientific	65001	ビオチン化プローブ-RNA-タンパク質複合体の捕捉用
DynaMag-15 マグネット	Thermo Fisher Scientific	12301D	磁性ビーズの分離用
DynaMag-2 マグネット	Thermo Fisher Scientific	12321D	磁性ビーズの分離用
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	リシスおよび洗浄バッファー中の二価カチオンのキレート用
エキソヌクレアーゼ I	New England Biolabs	M0293S	eCLIP cDNAの精製用
胎児ウシ血清（FBS）	Gibco	10099141C	トリプシン消化の停止用
ホルムアミド	Thermo Fisher Scientific	AM9342	ハイブリダイゼーションバッファー調製用
ハイブリダイゼーションオーブン	TUOHE	LF-I	プローブのハイブリダイゼーションとビーズの洗浄用
低融点アガロース	Sigma-Aldrich	A9414	eCLIP ライブラリサイズ選択用
MinElute Gel 抽出キット	Qiagen	28604	eCLIP ライブラリサイズ選択用
miRNeasy Mini キット	Qiagen	217004	RNA精製用
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	高塩洗浄バッファー調製用
ニトロセルロース膜	GE Healthcare / Amersham	10600002	eCLIP ウェスタンブロット転写用
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	洗浄バッファー洗剤用
核酸分解酵素およびプロテアーゼフリー水	Thermo Fisher Scientific	10977035	核酸分解酵素フリー溶液の調製用
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ゲル	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	eCLIP サイズ選択用
NuPAGE Bis-Tris プレキャストゲル	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	SDS-PAGE タンパク質分離用
PBS（pH 7.4）	Thermo Fisher Scientific	10010023	細胞の洗浄と再懸濁用
フェニルメチルスルホニル フッ化物（PMSF）	Sigma-Aldrich	P7626	セルリシスバッファーのセリンプロテアーゼ阻害剤；使用前に新鮮に添加
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Roche	4693132001	セルリシスバッファーの広域プロテアーゼ阻害剤；使用前に新鮮に添加
プロテイナーゼ K	Sigma-Aldrich	P4850	RNA抽出におけるタンパク質消化用
qRT-PCR マスターミックス	Thermo Fisher Scientific	11704044	RNA濃縮を確認するための定量的RT-PCR用
RNase/プロテアーゼフリー DNase I 溶液	Thermo Fisher Scientific	EN0521	組織の解離用
RNeasy Mini キット	Qiagen	74104	RNA精製用
SDS-PAGE サンプルローディングバッファー	Beyotime	P0286	タンパク質サンプル調製用
エビアルカリホスファターゼ	New England Biolabs	M0371S	eCLIP cDNA精製用
シルバー ステインキット	Beyotime	P00175	SDS-PAGE ゲルにおけるタンパク質の可視化用
ナトリウムデオキシコール酸	Sigma-Aldrich	D6750	洗浄バッファー洗剤用
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771	セルリシスとタンパク質変性用
Superase-in RNase インヒビター	Thermo Fisher Scientific	AM2694	特殊RNase インヒビター；使用前に新鮮に添加
T4 RNA リガーゼ	New England Biolabs	M0204	eCLIP アダプターのライゲーション用
Tris＆ndash;HCl（pH 7.0）	Sigma-Aldrich	T5941	リシス、ハイブリダイゼーション、および洗浄バッファーの調製用
TRIzol 試薬	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	RNA抽出用
超音波細胞破砕機	ATPIO	ATPIO-650D	細胞リシスとDNA断片化用
紫外線架橋装置	Analytik Jena	UVP CL-1000	RNA-タンパク質相互作用をUV架橋用
尿素	Sigma-Aldrich	U5128	膜上でのeCLIPタンパク質分解用