方法論記事

ハイコンテンツイメージングおよびデータ処理の標準化ワークフロー

DOI：

10.3791/71863

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2026年8月21日

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1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、自動画像取得および解析ワークフローを用いて再現性のある細胞生存率解析を行うための、プロピジウムイオダイド（PI）およびHoechst 33342で染色した細胞の標準化されたハイコンテントイメージングとデータ処理のプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

科学研究におけるイメージングの操作的なばらつきによる再現性の低さや、従来の手法を用いた大量のサンプルの解析の複雑さという課題を解決するため、HT22細胞をPIおよびHoechst 33342で染色し、ハイコンテンツイメージングシステムを用いて撮像およびデータ解析を行うプロトコルを紹介します。本ワークフローは、堅牢なイメージング設定パラメータと厳格な品質管理基準を確立することを目的としています。ここでは、装置のイメージング設定に加え、装置に搭載されている3つの異なる画像処理手法、すなわちMulti-Wavelength Cell Scoring (Multi)、Live-Dead (Live)、およびCustom Module Editor (CME)のワークフローを実演します。これらの画像処理手法の有効性を確認するため、従来の手法であるImageJを用いて比較および検証を行いました。最終的に本研究では、PIおよびHoechstの二重染色法を用いて細胞生存率を決定するための、ハイコンテンツイメージングシステムの利用ワークフローをまとめています。イメージングおよびデータ処理のワークフロー全体を標準化することで、科学研究におけるイメージングの再現性と信頼性が大幅に向上し、これにより研究室間でのデータ比較のための確実な方法論的根拠が提供され、科学研究の進展に寄与します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ハイコンテントイメージングシステムは、現代の科学研究において不可欠なツールであり、損傷した細胞または未損傷の細胞の高速度イメージングおよびマルチパラメータ評価を可能にします1,2,3。このシステムは、さまざまな分野で代替不可能な役割を果たしています。ライフサイエンスの分野では、細胞や組織の微視的な世界の探索において研究者を支援します4,5。例えば、細胞内の蛍光標識された分子や構造を精密に検出することで、細胞の微細構造や動的な変化を明確に可視化することができます6。神経科学研究においては、ニューロンの三次元イメージングが可能であり、神経ネットワークの複雑な接続や信号伝達メカニズムの解析を支援し、脳機能や神経疾患の病態生理を理解するための重要な手がかりを提供します7,8,9。

ハイコンテンツイメージングシステムの技術には大きな利点がありますが、そのイメージングプロセスには依然としていくつかの課題が残っています。試料調製段階では、主観性が非常に高くなっています。生物学的試料の調製において、細胞の取り扱いや染色などのプロセスには関連する標準基準が欠けています。イメージングパラメータに関しては、露光時間やウェルプレートの選択が、研究室やハイコンテンツ顕微鏡のモデルによって著しく異なります。データ処理フェーズでは、生画像のノイズ除去やコントラスト調整から、パラメータの特定や標的特徴の決定に至るまで、標準化が進んでいません。これらの問題は、顕微鏡イメージング結果に直接的なバイアスをもたらし、再現性の危機を引き起こしています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコールでは市販の細胞株（HT22, ATCC）を使用しており、ヒト被験者やヒト初代組織は含まれていません。また、本研究において動物は使用されていません。

1. 標準的なサンプル調製

  1. HT22細胞の調製
    1. HT22細胞のコンフルエンシーが80%に達したら10,11、古い培地を除去する。0.25%トリプシンを用いて細胞を剥離させ、室温で1–2分間インキュベートする。
    2. 0.25%トリプシンの3倍量のDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) を加え、剥離を停止させる。細胞懸濁液を15 mL遠心チューブに移す。
    3. 室温で175 x g、3分間遠心分離し、上清を除去する。完全DMEMで細胞を再懸濁し、単細胞懸濁液を作成する。
    4. 細胞計数器を用いて細胞数を計測する。96ウェルプレートの1ウェルあたり、完全培地100 µLに5,000個の細胞を播種する12。
    5. プレートを37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートする。実験計画に従い、96ウェルプレート内でサンプルの群分け、投与、および染色操作を行う。
      ​注：イメージングシステムに対応した96ウェルプレートを使用すること。メーカーの仕様に従い、適切な底面の厚さと形状を持つプレートを選択する。より高い画質が必要な場合は、ガラスボトムプレート（底面厚 130–170 µm）が推奨される13,14,15,16。
  2. 染色手順
    1. 細胞の重なりを最小限に抑えるため、細胞が単層で均一に分散し、コンフルエンシーが70%を超えないことを確認する（Figure 1B）。
    2. 実験要件に従ってサンプルを群分けし、処理後に染色を行う。PIの最終濃度を6.684 µg/mL、Hoechst 33342の最終濃度を10 µg/mLとした色素作動液を調製する17,18。
    3. 96ウェルプレートから古い培地を除去し、各ウェルを100 µLのPBSで2回洗浄する。色素作動液を加え、染色のために室温・暗所で30分間インキュベートする。
    4. 各ウェルを100 µLのPBSで2回洗浄し、その後DMEMを加える。
      注：実験計画によって、サンプルのロード量や染色のパラメータが異なる場合がある。

2. イメージング仕様およびパラメータ設定

  1. イメージングパラメータの標準設定
    ​注：本研究では、PIおよびHoechst 33342染色後の装置におけるワイドフィールドイメージングのワークフローのみを示します。
    1. 装置の電源を入れ、コンピュータを起動します。デバイスに付属の解析ソフトウェアを開きます。
    2. 96ウェルプレートを装置にロードします。イメージングを行うサンプルの視野を選択します。
    3. Objective（対物レンズ）およびCamera（カメラ）設定において、Magnification（倍率）を"20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230)、Camera binning（カメラビニング）を"2"、Acquisition Mode（取得モード）を"Widefield"に設定します。
    4. プレートモードで、96ウェルプレートの対応するパラメータを選択し、製品のサイズデータに従ってプレートパラメータを調整します。
    5. Site Option（サイトオプション）では、高密度イメージングのために通常1ウェルあたり9視野を選択します。Autofocus（オートフォーカス）オプションで、Enable laser-based focusing（レーザーベースフォーカシングを有効にする）を選択します。
    6. 少なくとも3つのサンプルウェルから測定した平均プレート底面厚に基づいて、Autofocusの下にあるレーザーオートフォーカスパラメータを調整します。Bottom thickness（底面厚）、Bottom thickness max variation（底面厚の最大変動）、Adjacent well max variation（隣接ウェル間最大変動）、Intra-well max variation（ウェル内最大変動）、およびPlate max variation（プレート最大変動）を適宜調整します。
    7. Wavelengths（波長）で、Number of wavelengths（波長数）を3に設定します。1つ目のIllumination（照明）としてDAPIを選択します。Shading Correction（シェーディング補正）では、"Auto Correction for FL"（FL用自動補正）を選択します（Figure 2B）。
    8. 画像を確認した後、初期のExposure (ms)（露光時間）を20–30に設定します。キャプチャされた画像を確認し、過露光にならず適度な蛍光強度が得られるまで露光時間を継続的に調整し、bit depth（ビット深度）を16に設定します（Figure 2A）。
    9. フォーカス調整には、z-offset付きのLaserを選択します。フォーカスが不鮮明な場合は、Use Z stackにチェックを入れ、Calculate Offsetをクリックして適切な焦点距離を選択します。Digital Confocal (info)にチェックを入れ、Increase Sharpness（シャープネス強調）およびReduce Noise（ノイズ低減）の調整パラメータを0.200に設定します。
      注：画像の露光量や鮮明度が不十分な場合は、露光量を調整し、オフセットパラメータを再計算してください。
    10. 2つ目のIlluminationとしてCy3を選択します。ステップ2.1.7から2.1.9と同じ設定に従います。
    11. 3つ目のIlluminationとしてTL 25を選択します。ステップ2.1.7から2.1.9と同じ設定に従います。
      注：チャンネルに基づいてシェーディング補正を設定し、TL 25ではAuto Correction for TL（TL用自動補正）を選択してください。Wavelengthsにおいて、TLチャンネルは細胞の位置決めおよび形態観察のために設定する必要があります。
    12. Run（実行）タブで、命名規則（プレート名-細胞種-実験ID-日付-対物レンズ倍率-イメージングタイプ）に従ってプレートに名前を付けます。Description（説明）の下でイメージングチャンネル関連のパラメータを確認します。
    13. Acquire Plateをクリックしてイメージングを開始します。イメージング完了後、ソフトウェア、装置、コンピュータの順に電源を切ります。
      ​注：その後、コンピュータは画像の書き出し、データ処理、および結果解析のためだけに起動してください。
  2. イメージング操作の標準および要求事項
    1. エッジ効果を避けるため、視野をウェルの中心に合わせます（Figure 1A）。イメージングパラメータの設定時には、最も蛍光強度の高いポジティブコントロールをリファレンスとして使用します。また、フォーカス合わせの際は、細胞が単層で、ゴミのない清潔な視野を選択してください。
    2. カメラについては、情報の永久的な喪失を招く飽和を防ぐため、ピクセル値を厳格に60000未満（最大値は65535）に制御します。飽和した輝点や領域が現れた場合は、露光時間を短くします。同時に、露光時間を短くしすぎないようにしてください。さもなければ、ノイズが画像に支配的になります。
    3. 蛍光信号が弱い場合は、光退色による不可逆的な損傷を避けるため、パラメータを強制的に上げるのではなく、露光時間をわずかに延ばすことを優先してください。
      注：明視野イメージングでは、これらの原則を適宜緩和できますが、核心的な焦点は信号の完全性とサンプルの保護にあります。
    4. サンプルのエッジ輪郭が明確に判別でき、内部の微細構造（顆粒、繊維、オルガネラなど）がぼやけることなく明瞭なテクスチャを持ち、背景の散乱光が局所的な輝点やぼやけたハローなく均一に分布していることを確認してください。オーバーフォーカスおよびアンダーフォーカスを厳格に避けてください。
    5. 正常群、ポジティブ群、ネガティブ群、および実験群が揃っていること、また各処理群に少なくとも3つのパラレルウェルがあることを確認してください。パラレルウェルは垂直に配置することを推奨します。

3. 画像処理および解析

注：このドキュメントでは、装置の付属ソフトウェアで提供される3つの画像処理方法について説明します。これらはすべて、本研究で用いた染色プロトコルに適しています。これらの方法は認識という基本的な原理は共通していますが、具体的な処理技術や得られるデータ結果の種類が異なります。画像処理のワークフローは共通して以下の通りです：ファイルを開く → 対応する処理方法で元の画像を読み込む → 適切なチャンネルパラメータを設定する → マスクを生成する → [Measure]で測定データの種類を設定する → 解析を実行する → 結果を確認する → データをエクスポートする。

  1. 装置に付属の解析ソフトウェアを開く → Review Plate → Select Plateを選択する。
  2. DateビューでWell arrangementを選択し、リファレンスとしてポジティブグループから視野を選択する。
  3. Run Analysisで、対応する処理プログラムを選択し、画像処理パラメータの設定または画像のエクスポートを行う。
  4. パラメータを設定して保存した後、パラメータ設定オブジェクトに基づいて、Run on all wells/ Run on selections/ Run on displayed siteのいずれかを選択する。
  5. コンピュータによるデータ処理が完了した後、MeasurementsタブのAnalysisで対応するデータ処理プログラムを選択し、Measurementで異なる測定結果を選択してデータを確認する。
  6. Open Logをクリックしてデータのエクスポートを開始する。3つの画像処理方法について、パラメータ設定で以下の詳細を設定する：
    1. 画像処理方法1：Multi-Wavelength Cell Scoring
      1. Multi-Wavelength Cell Scoringプログラムを選択し、設定を行う。Number of wavelengthsを設定する。AlgorithmにStandardを選択する。
      2. PI染色の結果に基づき、すべての核に対する認識パラメータを設定する。デフォルトのW1 Source画像はDAPIチャンネルである。
      3. 認識対象となる個々のオブジェクトのサイズに基づき、Approximate min widthを8–10 µm、Approximate max widthを30–35 µmに設定する。
      4. intensity above local backgroundを2,000–10,000 gray levelsに設定する。Previewを使用してテストし、認識結果に基づいて設定を調整する。
      5. Hoechst 33342染色の結果に基づき、W2パラメータを設定する。このチャンネルに名前を付ける。W2 Source画像はCy3である。
      6. Stained areaで、このチャンネルで染色された領域をNucleusとして選択する。その後の設定については、ステップ3.6.1.3–3.6.1.4と同じ設定に従う。Configure Summary LogまたはConfigure Data Log (Cells)で、希望する結果パラメータに基づいた対応するParameter configurationを選択する。
        注：通常、Configure Summary Logは必要なデータタイプを設定するために使用され、Configure Data Log (Cells)は個々の細胞の特別なマーキングが必要な場合に使用される。
      7. Test Runを実行して認識状態を確認する。認識結果に満足した場合は、設定を保存する。
    2. 画像処理方法2：Live-Dead
      1. Live-Deadプログラムを選択し、設定を開始する。Wavelength 1 ParametersとWavelength 2 Parametersを順に設定する。
      2. Wavelength 1 Parametersで、Wavelength 1 SourceをDAPIに設定する。デフォルトのAlgorithmは"Standard"である。
      3. 染色条件に基づき、Stained cell typeをAll Cellsに、Stained areaをNucleusに設定する。Approximate min width、Approximate max width、およびintensity above local backgroundは、Multi-Wavelength Cell Scoring法と同じ設定を使用する。
      4. Split touching objectsにチェックを入れ、Previewを使用してテストする。
      5. Wavelength 2 Parametersで、Wavelength 2 SourceをCy3に設定する。
      6. 特定の染色に基づき、Stained cell typeをDeadに、Stained areaをNucleusに設定する。Approximate min width、Approximate max width、およびintensity above local backgroundは、Multi-Wavelength Cell Scoring法と同じ設定を使用する。
      7. Configure Summary Logをクリックし、必要なデータタイプに基づいたParameter configurationを選択する。Test Runを実行して認識状態を確認する。認識結果に満足した場合は、設定を保存する。
    3. 画像処理方法3：デベロッパーモード CME
      1. Custom Module (CME)プログラムを選択し、設定を開始する。Image Namesとチャンネルを設定する。
        注：その後のパラメータ設定を容易にするため、通常はイメージング時に使用したチャンネル名に設定する。
      2. Find ObjectsでSimple Thresholdを開き、セット全体の認識を設定する。
      3. SourceをImage Nameに対応させる。16-bitグレースケール値の範囲に基づき、Threshold Lowに0、Threshold Highに65535を入力する。
      4. Resultに処理結果の名前を入力し、applyしてマーキング状況を確認する。Find ObjectsでFind Blobsを開き、Mask結果を生成する。
      5. Simple Thresholdと同様に、SourceをImage Nameに対応させる。Approximate min width、Approximate max width、およびintensity above local backgroundをMulti-Wavelength Cell Scoringの設定通りに設定する。
      6. Resultに処理結果の名前を入力し、applyしてマーキング結果を確認する。Find Blobsの認識結果に対して、Modify Objectsツールを使用してフィルター、grow、shrink、invertを行う。
      7. MeasureでModifiedを設定する。Measurement Inputsで、Standard Area Valueに1を入力し、Create Object Overlayにチェックを入れる。
      8. Objects to Measureで、Mask of Objectsにマークされたオブジェクトのソースを、Image to Measureに測定対象のソース画像を選択する。必要な処理結果パラメータに基づいて対応するMeasurement Nameを選択し、applyしてパラメータ認識結果を確認する。
      9. パラメータ設定を確認後、構成を保存する。
    4. 一般的手法：ImageJ
      ​注：蛍光画像に対してImageJ法19を用いてイメージング結果を解析し、その後、本装置の3つの手法との比較解析を行う。
      1. ImageJソフトウェアを開く。画像のインポート：File → Open → 解析する元のグレースケール画像を選択する。
      2. 画像を8-bitに変換する：Image → Type → 8-bit。グレースケール値の認識：Image → Adjust → Threshold → Default、Red → Check Dark backgroundにチェック → Set → OK。
        注：赤色領域の認識が不十分な場合は、Defaultを他の16個の内蔵ImageJ認識モデルのいずれかに変更するか、ダイアログボックスのスライダーを調整する。
      3. パラメータ設定：Analyze → Set Measurements。ポップアップダイアログボックスで、Area、Mean gray value、Integrated density、Limit to threshold、Display labelにチェックを入れ、Redirect toはデフォルトのNoneにし、Decimal places (0-9)に2を入力する。OKをクリックする。
      4. 認識結果の解析：Analyze → Measure。結果の保存：ポップアップ結果ダイアログボックスで、File → Save Asを選択し、保存場所を指定する。
  7. 画像のエクスポート
    1. 高品質なポジティブウェルの視野をリファレンス標準として選択する。
      注：基本的な品質要件は、真正性、正確なフォーカス、適切な露光（16-bit）、および適切なコントラスト（SN比が高い方が望ましい）である。高品質な要件には、明確な特徴、コントラスト、実用性、直感的な形態変化、およびキーポイントの強調が含まれる。
    2. Run AnalysisのAnalysisセクションでExportProを選択し、Run Setup for Analysisを開始する。Select output optionsで、画像の要件に基づき、Individual channel、Color overlay、shrink image（任意）、Scale bar（任意）を選択する。
    3. 各視野について、エクスポートする蛍光チャンネル画像を選択する。Individual Channelで、各チャンネルに色を選択する（例：DAPIチャンネルはBlue、TLチャンネルはMonochrome）。
    4. Color overlayで、BRIGHTFIELD、RED、BLUE、GREENに対応するチャンネルを順に選択する（カラーオーバーレイ用の色波長を選択）。Numberを100に設定し、プレビュー画像を確認してプレビュー結果を承認する。
    5. outputのExport to folderで、エクスポートした画像を保存するフォルダーを選択する。実行を開始する。
      注：同一バッチの画像を個別にエクスポートしてはならない。バッチとは、完全に同一の実験条件下で得られた、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、基本コントロール群、標的実験群の4つのコアサンプルからなる画像セットを指す。
  8. 画像処理方法の比較
    1. 9つの視野を選択し、死細胞と生細胞の従来の目視計数と、Multi-Wavelength Cell Scoring、Live-Dead、CME、ImageJの各手法による生細胞数、死細胞数、および死細胞/生細胞比の計数を比較する。GraphPad Prism version 10.1を使用して一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、Tukeyの多重比較検定を併用して差異を解析する。
    2. 81つの視野を選択し、Multi-Wavelength Cell Scoring、Live-Dead、CME、ImageJの各手法間での細胞数、面積、および強度の差異を比較する。GraphPad Prism version 10.1を使用して一元配置分散分析（one-way ANOVA）を行い、Tukeyの多重比較検定を併用して差異を解析する。
      注：細胞培養および染色実験は、必ずバイオセーフティキャビネット内で行うこと。廃液、チップ、その他の実験廃棄物は、研究室の規定に従って廃棄すること。実験中は十分な保護策を講じること。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

標準化された作製法が画像品質に及ぼす影響

装置が細胞画像レイヤーを確実に特定できるよう、プレートパラメータを設定しました。細胞を適度なコンフルエンスの単層として調製することで、異なる対物レンズ倍率でのフォーカシングが容易になり、画像認識および定量解析の向上が図られました。サンプルの調製を標準化し、プレートパラメータを最適化したことで、エッジエフェクトや細胞の重なりなど、画質の低下を招く要因を効果的に最小限に抑えることができました（図1）。

画像計算手法の機能比較

生細胞と死細胞を区別するために、PI/Hoechst 33342二重染色法を用いた。Multi-Wavelength Cell Scoring、Live-Dead、およびCMEの手法では、蛍光強度とオブジェクトサイズに基づいてオブジェクトを識別することで、これらの画像を正常に処理できたが、ImageJではグレースケール値に基づいてオブジェクトを識別した。これらの手法で得られたマーキング結果は、概ね同等であった（図3A–E）。

多波長細胞スコアリング法では、すべての細胞を特定するために核染色が必要となります（図4A）。この手法では最大7つのイメージングチャンネルを処理でき、細胞数、面積、光学密度などのパラメータを算出することが可能です。

Live-Dead法は、Multi-Wavelength Cell Scoring法よりも柔軟性が高い。どちらのチャンネルでも、核染色、細胞質染色、または核と細胞質の複合染色用のモジュールが提供されており、すべての細胞、生細胞、または死細胞を識別できる。Split touching objects機能は、重なり合ったオブジェクトを分離し、細胞数、面積、および光学密度の算出を可能にする。しかし、この機能はデュアルチャンネルデータのみを処理するため、PI/Hoechst 33342で二重染色した細胞生存率アッセイに特に適していた（図 4B）。

CME法は、ユーザー定義の画像処理ロジックに依存していました。処理されるチャンネル数は、取得されたチャンネル数に対応していました。認識結果は、不純物やその他の干渉源を除去するために、Fill Holes、Invert Objects、Grow Objects、Shrink Objects、Logical Operations、Remove Border Objects、Keep Marked Objects、Grow Objects without Touching、Mark Object Centers、Watershed、Remove Marked Objects、およびFilter Maskなどの関数を用いて精緻化されました。また、この手法により、多次元解析のための複数のオブジェクトパラメータの算出が可能となりました。

ImageJでは、複数のチャンネルを同時に処理することができませんでした。背景の変動が大きい画像バッチについては、手動での処理と閾値調整が必要であり、主観性が増し、再現性が低下しました。

処理結果の差異の解析

画像処理法の比較分析の結果、9つの視野における総細胞数、死細胞数、および死細胞/全細胞比について、Multi-Wavelength Cell Scoring法、Live-Dead法、CME法、ImageJ法、および従来の目視計数法の間に有意な差は認められなかった (Figure 5A–C, Supplementary File 1)。

同様に、Multi-Wavelength Cell Scoring、Live-Dead、CME、およびImageJの各手法間で、総細胞面積に対する死細胞面積の比率に有意な差は見られなかった。しかし、81視野から得られたデータに基づくと、Multi-Wavelength Cell Scoring、Live-Dead、およびCMEの各手法間で、全細胞の平均蛍光強度に対する死細胞の平均蛍光強度の比率に有意な差が認められた（Figure 5D–F）。

これらの知見に基づき、ハイコンテンツイメージングシステムの標準化されたワークフローを確立した（図6）。

figure-results-1
図1: 低品質な撮像結果。 (A) 視野がウェルの端に近く、ウェル端による影が生じている（この場合はBV2細胞）。 (B) 矢印aおよびbは、DAPIチャンネルとTLチャンネルにおける細胞の重なりを示しており、細胞のコンフルエンシーが過剰であるか、あるいは二層形成や浮遊細胞が存在している。 (C) 視野内に細胞が存在しない。プレートパラメータの設定ミス、細胞層へのフォーカス不全、または細胞の染色不良により、この視野に画像が得られていない。スケールバー = 100 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: イメージングパラメータの設定。 (A) 矢印aはビット深度アイコンを示す。 (B) 矢印bはシェーディング補正の位置を示す。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-3
図 3: 複数の手法によって同定された同一視野の結果。 (A) Multi-Wavelength Cell Scoring マスクの結果：灰色と赤色の領域は DAPI チャネルで同定されたすべての細胞核を表し、赤色の領域は Cy3 チャネルで同定された死細胞の核を表す。 (B) Live-Dead マスクの結果：緑色と赤色の領域は DAPI チャネルで同定されたすべての細胞核を表し、赤色の領域は Cy3 チャネルで同定された死細胞の核に対応する。 (C) CME マスクの結果：黄色と青色の領域は DAPI チャネルで同定されたすべての細胞核を表し、青色の領域は Cy3 チャネルで同定された死細胞の核に対応する。 (D) ImageJ による DAPI のマスク結果。 (E) ImageJ による Cy3 のマスク結果。スケールバー = 100 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4一部のパラメータ設定ページ。 (Aaで示された位置は、Multi-Wavelength Cell Scoringの第1チャンネルでは核のみを選択できることを示しています。Bbおよびcは、Live-Deadが2つのチャンネルのみを処理可能であり、死細胞および生細胞に対するPI/Hoechst 33342二重染色はサポートしていることを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図 5: 蛍光画像処理結果の相違。 (A) 5つの処理方法間における全細胞数の相違。 (B) 5つの処理方法間における死細胞数の相違。 (C) 5つの処理方法間における全細胞に対する死細胞の比率の相違。 (D) 4つの処理方法間における全細胞に対する死細胞の比率の相違。 (E) 4つの処理方法間における全細胞面積に対する死細胞面積の比率の相違。 (F) 4つの処理方法間における全細胞の平均蛍光強度に対する死細胞の平均蛍光強度の比率の相違。チャート内のすべてのエラーバーは標準偏差を示す。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-6
図 6: 標準操作手順。サンプル調製、蛍光染色、ハイコンテントイメージング、画像処理、画像エクスポート、およびデータ解析の標準化された手順をまとめたワークフロー。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足ファイル1. 図5に示した細胞数、面積、および蛍光強度の解析に関する生データ こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PIおよびHoechstによる二重染色法を用いて細胞生存率を判定する場合、例えばハイコンテンツ解析装置では、組み込みのアルゴリズムモジュールを使用して、同一バッチ内の細胞生存率を迅速かつハイスループットに算出できます。この手法には、サンプル量の少なさ、低コスト、細胞へのダメージの最小化、蛍光退色の少なさ、消光への耐性、および複数画像のキャプチャが可能であることなど、多くの利点があります。さらに、96ウェルプレートのイメージング時間は、通常わずか30–45 min20です。

実験プロトコルにおいて、イメージングの品質を確保するためには、以下のステップに重点を置いてください。第一に、適切なプレート密度を確保し、細胞密度が高すぎて画像が細胞で埋め尽くされたり、逆に密度が低すぎて染色や洗浄の過程で細胞が洗い流されたりすることを避けてください。第二に、残留した染料がイメージングに影響を与えないよう、染料を十分に洗浄してください。接着性の低い細胞の場合、染色の前後における液体の添加と除去は、垂直に加えないよう、ゆっくりと丁寧に操作してください。視野の中心部の細胞が脱落するのを防ぐため、壁面に沿って液体を添加し、特に生存率アッセイ中の死細胞の脱落に注意してください。必要に応じて、実験誤差を減らすためにサンプルプレートを遠心分離することを検討してください。第三に、適切な露光時間を選択してください。露光時間が長すぎると、イメージング全体の時間が延びて検出ウィンドウを逃す可能性があり、一部の細胞の過露光や背景の誤認識につながる恐れがあります。露光時間が短すぎると、画像情報が不十分となり、一部の特徴的な詳細が失われる可能性があります。

イメージング中に鮮明な画像が得られない場合は、細胞の状態、染料の残渣、パラメータ設定、その他の要因に遡って問題を特定してください。実験中にウェルの底に細胞が存在しない場合、視野内に画像は検出されません。ウェルの底に2層以上の不均一な細胞層が形成されると、フォーカシングが困難になり、画像がぼやける原因となります。染料の残渣が過剰にあると背景強度が高くなり、ターゲットとなる画像が不明瞭になります。広範囲にわたる染料の残渣は視野内の細胞を遮る可能性があり、細胞と同程度のサイズの小さな残渣粒子は、その後の画像認識やセグメンテーションを妨げる可能性があります。96ウェルプレートのメーカー仕様に従ってプレートの高さおよびウェルの高さを設定していない場合、視野内に画像が見つからないか、あるいはサンプル位置がずれ、対物レンズを損傷させる恐れがあります。

操作の柔軟性と簡便さ、および良好なデータ処理結果を考慮すると、PIおよびHoechst二重染色の方法において最適な画像処理モジュールはLive-Deadである。このプログラムはPIおよびHoechst染料に特化して最適化されており、他の手法やソフトウェアと比較して操作が簡単で、計算速度が速く、一貫したパラメータ設定で画像をデータベースに一括ロードすることが容易である。その結果は、現在一般的に使用されているソフトウェアであるImageJで得られる結果よりも比較可能性が高い。実験モードに応じて、対応する専用メソッドまたはMulti-Wavelength Cell Scoring汎用計算モードを使用することができる。専用メソッドの方が利便性が高い一方、汎用計算モードは染色方法への制限が少ない。染色プロトコルによって、必要となる最適な画像処理モジュールは異なるため、実験目的に合わせて計算手法を構築することである。画像書き出しのためのExportProメソッドはシンプルで習得しやすく、参照オブジェクトのプレビューが可能である。グラフィカルなインターフェースによってパラメータの意味が明確に説明されており、測定が簡略化されているため初心者にとっても使いやすく、複数のソフトウェアを用いた解析への障壁を低減し、ツールの習得時間を短縮できる。

本研究では、基本的な染色プロトコルの検証のみを行いました。参考として、本プロトコルとは大きく異なる他の実験プロトコルについては、引き続き新しい標準を用いて検証する必要があります。

ハイコンテンツイメージングシステムは、高解像度イメージング、マルチパラメータ同期検出、自動定量分析、およびハイスループットスクリーニングを統合したコアテクノロジープラットフォームとして機能します21,22,23。この装置のイメージング能力と計算能力の統合設計により、より多くの既存のイメージング実験に対応する実験プロトコルおよび計算モデルの開発と確立が可能になると期待されており7,24、最終的には、異なる操作者、異なる時期、およびバッチ間で得られるデータの整合性と比較可能性を向上させることができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はすべて、利益相反がないことを宣言します。原稿の翻訳において、Zhipu AIは翻訳のみに使用され、研究データ、実験結果、または核心的な学術的内容の生成には使用されていません。著者は原稿の内容について全責任を負います。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、成都中医药大学学校基金による支援に感謝いたします。また、助成金MPRC2022034による支援に感謝いたします。本資金は、単純性肥満マウスに対する二陳湯による治療における腸内細菌の3Dダイナミックイメージング法の開発に使用されました。著者らは、成都中医药大学中医药创新研究院および交叉学科研究院が提供した研究プラットフォームに謝意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLЦентリフュージチューブLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
1000 µL ピペットチップLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
15 mLセントリフュージチューブLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
2.5 µL ピペットチップQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
200 µL ピペットチップLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
50 mLセントリフュージチューブLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
96ウェル細胞培養プレートCorning Incorporated3599
調節可能シングルチャンネルピペット、0.1–2.5 μLEppendorf SE3120000216
調節可能シングルチャンネルピペット、100–1000 μLEppendorf SE3120000267
調節可能シングルチャンネルピペット、20–200 μLEppendorf SE3120000259
調節可能シングルチャンネルピペット、2–20 μLEppendorf SE3120000232
細胞培養ディッシュCorning Incorporated430167
凍結保存バイアルLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
ジメチルスルホキシド (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)Life Technologies Limited11966-025本研究では、10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、および89% DMEMを用いて完全DMEMを調製した。
ESCO CelCulture CO2 インキュベーターEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
ウシ胎児血清 (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Hoechst 33342 蛍光染料Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
HT22細胞Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJは、本論文で使用された画像処理ソフトウェアの1つである。
ImageXpress Micro 共焦点ハイコンテンツイメージングシステムMolecular Devices, LLCImageXpress Micro Confocal論文内では、装置名の代わりに「ハイコンテンツイメージングシステム」を使用する。
低速凍結遠心機Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
MetaXpress ハイコンテンツ画像取得・解析ソフトウェアMolecular Devices, LLCこのソフトウェアは、ImageXpress® Micro 共焦点ハイコンテンツイメージングシステムの付属ソフトである。論文内では、「装置に付属の解析ソフトウェア」はこのソフトウェアを指す。
OptiMair 垂直層流キャビネットEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
プロピジウムヨード溶液 (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
トリプシン-EDTA溶液BasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

参考文献

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