便秘型過敏性腸症候群における微生物代謝物関連宿主遺伝子の優先順位付けのための計算ワークフロー

サマリー

本プロトコルでは、微生物代謝物ターゲット予測、直腸粘膜トランスクリプトーム解析、タンパク質-タンパク質相互作用およびパスウェイ濃縮解析、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、および分子力学/ポアソン・ボルツマン表面積（MM-PBSA）結合自由エネルギー推定を統合し、実験的検証に向けた、ランク付けされた仮説生成用の代謝物関連ホスト遺伝子の候補リストおよび構造的に優先順位付けされたタンパク質-リガンド複合体を導き出します。

要約

公開されている化学、ゲノム、および構造データベースから、微生物代謝物に関連するホスト遺伝子やタンパク質-リガンド複合体を体系的に優先順位付けするための標準化された計算パイプラインは存在しません。本記事では、ユーザーが定義した腸内細菌叢由来の代謝物セットを入力し、実験的な後続検証に向けた、候補となる代謝物関連ホスト遺伝子のランク付けされたショートリスト、濃縮された生物学的パスウェイ、および構造的に優先順位付けされたタンパク質-リガンド複合体を出力する8段階のワークフローについて説明します。このパイプラインは、(i) ケモインフォマティクスによる代謝物プロファイリング、(ii) タンパク質-化学物質相互作用およびリガンドベースのターゲット予測ツールと分子ドッキングプログラムを用いたマルチデータベースによる候補ターゲット予測、(iii) 公開されているトランスクリプトームデータの差分遺伝子発現解析、(iv) ターゲットと差分発現遺伝子のオーバーラップ解析、(v) タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築とパスウェイ濃縮解析、(vi) 分子ドッキングプログラムを用いた分子ドッキング、(vii) 分子動力学シミュレーション用のタンパク質力場を備えた分子動力学エンジンを用いた 200 ns の分子動力学シミュレーション、および (viii) MM-PBSA による結合自由エネルギー推定を統合しています。実証例として、短鎖脂肪酸、胆汁酸、トリプトファン由来代謝物、およびウロリチン A を代表とする9つの腸内細菌叢由来または細菌叢により修飾された代謝物を、公開されている IBS-C 直腸粘膜トランスクリプトームデータセット GSE36701 を用いて処理しました。その結果、このデータセットで差分発現していた17個の固有の予測代謝物関連遺伝子がランク付けされました。ドッキング、分子動力学シミュレーション、および MM-PBSA 解析により、5つの代謝物-タンパク質複合体が構造的に優先順位付けされました：リトコール酸-VDR、リトコール酸-NR1H4/FXR、ウルソデオキシコール酸-NR1H4/FXR、トリプタミン-HTR2A（明示的な 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) 脂質二重層内でシミュレーション）、およびウロリチン A-CASP3 です。本プロトコルは、他の代謝物セット、疾患トランスクリプトームデータセット、およびターゲットクラスに適応できるように設計されています。すべての出力は仮説生成のための計算上の予測であり、因果関係や治療上の結論を導き出す前に、独立したトランスクリプトームによる再現、タンパク質レベルでの検証、および機能的なリガンド応答アッセイが必要です。

概要

便秘型過敏性腸症候群（IBS-C）は、反復的な腹痛、排便習慣の変化、膨満感、および便秘を特徴とする一般的な機能性胃腸疾患であり、世界的な有病率は一般人口の約10–15%と推定されています^1,2。分泌促進薬、プロキネティクス、および鎮痙薬を含む現在の薬物療法は、一部の患者において個々の症状を改善させることができますが、治療反応は不均一であり、持続的な寛解が得られることは稀です。これは、本疾患の複雑で多因子的な病態生理を反映しています^1,3,4。したがって、新規の治療標的に対する検証可能な仮説を立てるには、腸内細菌のシグナルが粘膜レベルでどのように伝達されるかについて、より完全なメカニズムの理解が必要です。

腸内細菌叢は、短鎖脂肪酸（SCFA）、二次胆汁酸、トリプトファン由来化合物、およびウロリチンなどのポリフェノール由来代謝物を含む、化学的に多様な代謝物の産生および生物学的変換を通じて、下部消化管の恒常性に寄与しています^5,6,7,8。これらの分子は、標準的な代謝物感知膜受容体にとどまらず、核内受容体、細胞質酵素、ヒストン修飾タンパク質、ペプチドホルモン前駆体、および細胞内シグナル伝達タンパク質にまで及ぶ、広範かつ完全には解明されていない分子標的のレパートリーを介して宿主細胞と通信します⁹。過敏性腸症候群（IBS）患者において、腸内細菌叢の組成および代謝物プロファイルの変動が報告されており、これにより、微生物代謝物への応答に関連する宿主遺伝子がIBS-C（便秘型過敏性腸症候群）の直腸粘膜において転写的に変動しているかどうかを調査する生物学的根拠が得られています¹⁰。

9種類の代謝物パネルは、腸内細菌叢由来または細菌叢によって修飾された低分子化合物のセットとして、簡潔で化学的に多様であり、かつ生物学的に解釈可能な構成となるよう、事前に定義されました。選択基準は以下の5点に基づいています：ホストと細菌叢のシグナリングに関与する主要な微生物代謝物クラスを代表していること、遠位腸管粘膜への曝露が既知であるか、あるいは妥当であること、一意なPubChem識別子および標準構造が利用可能であること、リガンドベースの標的予測およびドッキングに適した分子サイズと構造的追跡可能性を有すること、そしてIBS-Cにおける上皮、神経免疫、腸内分泌、核内受容体、または運動機能に関連するシグナリングへの関与が事前に妥当であること。選択されたパネルには、短鎖脂肪酸（SCFA）として酪酸とプロピオン酸、胆汁酸としてケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、トリプトファン由来代謝物としてトリプタミン、インドール-3-プロピオン酸、インドール-3-乳酸、そして腸内細菌叢由来のポリフェノール代謝物としてウロリチンAが含まれました^5,6,7,8,9,10.

これまでの計算科学的および実験的な研究の多くは、個々のメタボライト-受容体またはメタボライト-酵素のペアを単独で検討してきましたが、このアプローチでは、ホストの経路全体にわたる微生物メタボライトシグナリングの分散的かつ収束的な性質を捉えることができません^9,11。複数の解析段階を統合することで、単一の段階では独立して提供できない、相互に補完的なフィルタリング能力が得られます。キュレーション済みデータベースを用いた計算的なターゲット予測により、各メタボライトに対して広範な候補ホストタンパク質のセットが抽出されます。これを疾患関連のトランスクリプトームデータと照らし合わせることで、このセットは大幅にフィルタリングされ、疾患の状況下で転写物が変動している候補のみが保持されます。その後、パスウェイ濃縮分析およびタンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク分析により、絞り込まれた候補リストを既知の生物学的モジュールにマッピングします。分子ドッキングにより、各候補複合体の結合ポケットの相補性について初期の計算的評価を行い、さらにMM-PBSA結合自由エネルギー分解を伴う200 nsの分子動力学（MD）シミュレーションを行うことで、ドッキングスコアだけでは得られない、構造的優先順位付けに対する時間分解能を持つ熱力学的次元を付与します。体系的な統合と逐次的なフィルタリングを行わず、各ステップを独立して実施した場合、候補リストが広範になりすぎて実験的に扱うことが困難となり、収束的なパスウェイ構造を検出することができなくなります。

本プロトコルの枠組みにおいて、「代謝物関連遺伝子（MAG）」という用語は、少なくとも1つのキュレーション済み計算予測データベースによって、そのタンパク質産物が1つ以上の腸内細菌由来代謝物の推定分子標的として指名され、かつ、ワークフローの実証に使用された疾患関連のトランスクリプトームデータセットにおいて、その転写物が特異的に発現しているヒト遺伝子を指します。この操作的定義には、膜受容体および核受容体に加え、細胞質酵素、シグナル伝達タンパク質、ペプチドホルモン前駆体、およびその他の細胞内タンパク質を意図的に含めています。MAGの指定は、代謝物が結合し、タンパク質-リガンド複合体を形成し、受容体を活性化し、タンパク質量を変化させ、あるいは疾患を引き起こすという実験的な証拠ではなく、実験的な検証を必要とする、計算的に導き出された仮説生成のための指名であると考えてください。

本プロトコルでは、独立した再現や、他の代謝物パネルまたは疾患データセットへの適応、および他の宿主-微生物叢相互作用のコンテキストへの拡張を可能にする十分な操作詳細を備えた、全8段階の計算ワークフロー（図1）について記述します。このワークフローは、公開されているオミクスおよび構造リソースのみを用いて動作する、仮説生成および構造的優先順位付けのためのフレームワークとして明確に定義されており、計算出力のみから代謝物濃度の変化、受容体の活性化状態、タンパク質発現の変化、下流のシグナリング活性、または臨床的意義を推論するものではありません。ここでは、9つの腸内細菌叢由来または細菌叢により修飾された代謝物と、公開されているIBS-C直腸粘膜トランスクリプトームデータセットGSE36701を用いた具体例として本プロトコルを実演し、MAGの同定および、その後の実験的検証に向けた代謝物-タンパク質複合体の優先順位付けを行うことを目的とします。

プロトコル

本解析では、GSE36701から得られた公開済みの匿名化済みトランスクリプトームデータ、および公開されている化学、タンパク質、構造データベースのみを使用しました。これらのデータベースには2026年1月から5月の間にアクセスしました。それ以降のアクセス日については、別表の材料リスト（Table of Materials）に記載しています。

1. 研究デザイン、ハードウェアおよびソフトウェアの要件

1. 解析を開始する前にワークフローを定義する。代謝物選択、ターゲット予測、発現変動解析、ターゲットと変動発現遺伝子（DEG）のオーバーラップ、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）/パスウェイ解析、分子ドッキング、MDシミュレーション、およびMM-PBSA推定の8つのステージを用いる。
2. ドッキング、MD、およびMM-PBSAは、構造的な優先順位付けのためのツールであるのみであることを記録する。これらの出力を、結合、受容体活性化、タンパク質存在量の変化、治療効果、または疾患の因果関係に関する実験的証拠として解釈してはならない。
3. MDシミュレーションを実行する前に、計算ハードウェアを確認する。64ビットLinux OS、6コア以上のCPU、8 GB VRAM以上のGPU加速プラットフォーム、またはそれに相当する8 GB VRAM以上のGPU加速プラットフォームを使用し、最低32 GBのRAM、およびMDシステムあたり少なくとも200 GBの空きストレージを確保する。
4. コアソフトウェアを記録する：分子動力学エンジン、代謝物リガンドのターゲットタンパク質への分子ドッキングソフト、化学ファイル形式変換ソフト¹²、三次元リガンド生成ソフト、リガンド調製ソフト、ドッキング入力調製ツールキット、代謝物リガンドのターゲットタンパク質への分子ドッキングソフト、汎用プログラミング環境、バイオインフォマティクスソフトウェアフレームワークを備えた統計計算環境、および遺伝子発現変動解析パッケージ。
5. 構造解析ツールを記録する：ウェブベースの膜システム構築ツール、CHARMM互換のリガンドパラメータ化サービス、分子力学/連続体溶媒結合エネルギー計算ツール、分子トポロジーおよびパラメータ変換ライブラリ、三次元分子可視化プログラム、および分子可視化・二次元相互作用ダイアグラムツール2021（ダウンロードリンクとバージョン情報については、Table of Materialsを参照）。
6. 分子動力学シミュレーションに使用した正確なタンパク質力場、CGenFF、CHARMM-GUI、R/バイオインフォマティクスソフトウェアフレームワーク、および分子力学/連続体溶媒結合エネルギー計算ツールのリリース識別子を、Table of Materialsまたは環境ファイルに記録する。識別子が不明な場合は「not recoverable」と記載し、推測して記入しないこと。

2. メタボライトの選定とケモインフォマティクスによる特性評価

1. ターゲット予測の前に、代謝物パネルを定義する。酪酸 (PubChem CID: 264)、プロピオン酸 (CID: 1032)、ケノデオキシコール酸 (CID: 10133)、リトコール酸 (CID: 9903)、ウルソデオキシコール酸 (CID: 31401)、トリプタミン (CID: 1150)、インドール-3-プロピオン酸 (CID: 3744)、インドール-3-乳酸 (CID: 92904)、およびウロリチンA (CID: 5488186) を含める。
2. 各代謝物の標準的なSMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) およびPubChem CIDを取得する。ターゲット予測の前に、同義語と構造の重複を確認する。最終的な識別子を代謝物マスターシートに保存する。
3. 標準SMILES文字列を、物理化学的特性およびADME予測ウェブツール¹³ (材料表を参照) に入力する。分子量、トポロジカル極性表面積 (TPSA)、コンセンサスlogP、水素結合ドナー数、水素結合アクセプター数、回転可能結合数、予測胃腸吸収能、P-糖タンパク質予測、ならびにLipinski、Veber、Ghose、Egan、Muegge、およびPAINSのアラートを記録する。
4. 構造認識に成功し、分子量が500 Da以下で、PAINSアラートがない代謝物を保持する。不合格となった基準と、その代謝物を保持または除外した決定理由を記録する。
5. 後続のターゲット予測およびドッキングの前に、イオン化状態を割り当てる。酪酸とプロピオン酸には脱プロトン化したカルボキシレートを、胆汁酸には中性のカルボン酸形態を、トリプタミンにはプロトン化したアンモニウムを、その他の代謝物には中性形態を使用する。

3. ヒトにおける標的候補の予測

1. 化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測ツール¹⁴（材料表を参照）を開く。各代謝物の名称またはPubChem CIDを入力し、Homo sapiens（タクソノミーID：9606）を選択し、最小複合相互作用スコアを≥0.700に設定する。
2. 化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測において、実験的エビデンスおよびキュレートされたデータベースのエビデンスチャネルを優先する。各代謝物の完全なタンパク質関連テーブルをダウンロードする。
3. 分子ドッキングプログラム¹⁵（材料表を参照）を開く。Homo sapiensを選択した状態で、各標準SMILES文字列を送信し、確率が≥0.70のターゲットを保持する。
4. 化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測の結果と分子ドッキングプログラムの結果を、各代謝物の和集合として統合する。いずれかのデータベースの閾値を満たすターゲットを保持し、完全に重複する遺伝子シンボルのエントリを削除する。
5. タンパク質識別子を標準化されたHGNC承認遺伝子シンボルへマッピングするツール、または統合ヒト遺伝子情報データベース（材料表を参照）を使用して、タンパク質エントリをHUGO遺伝子命名法委員会（HGNC）承認の遺伝子シンボルに標準化する。エイリアス、旧シンボル、およびアイソフォーム注釈を、1タンパク質あたり1つの遺伝子シンボルに解消する。
6. 各ターゲットを、膜受容体、核受容体、酵素、細胞内シグナル伝達タンパク質、ペプチドホルモン、ホルモン関連タンパク質、またはその他の細胞内タンパク質に分類する。ターゲットテーブルにその分類を記録する。

4. トランスクリプトームデータセットおよび差分的遺伝子発現解析

1. NCBIのウェブベース差分的遺伝子発現解析ツール^16,17（Table of Materialsを参照）を通じてGSE36701にアクセスする。このデータセットに、IBS-C、下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）、感染後IBS、および健康なボランティア群の直腸粘膜生検の発現データが含まれていることを確認し、記録する¹⁸。
2. 独立した検証コホートを特定するために、GEOおよびArrayExpressを検索する。検索には、IBS-C、constipation-predominant irritable bowel syndrome、rectal mucosa、colonic mucosa、biopsy、transcriptome、microarray、およびRNA-seqの組み合わせを用いる。リポジトリ、検索ワード、検索日、および比較可能な検証データセットが特定されたかどうかを記録する。
3. GSE36701のレコードからウェブベース差分的遺伝子発現解析ツールを起動する（Table of Materialsを参照）。18検体のIBS-CサンプルをIBS-C群に、40名の健康なボランティアをコントロール群に割り当て、IBS-Dおよび感染後IBSのサンプルは未割り当てのままにする。
4. Benjamini-Hochberg法による偽発見率（FDR）補正を用いた差分的遺伝子発現解析パッケージフレームワークを用いて、差分的発現解析を実行する¹⁹。プローブID、遺伝子シンボル、遺伝子名、logFC、AveExpr、調整済みt統計量、未補正P値、および調整後P値を含む完全な結果テーブルをダウンロードする。
5. プローブを遺伝子レベルのエントリに集約する。遺伝子シンボルのないプローブは除外し、重複するシンボルの場合はFDRが最も低いプローブを保持する。FDRが同一の場合は、絶対値の大きい方のlogFCを優先的に採用する。

5. ターゲットと変動遺伝子（deg）のオーバーラップ解析および統計的評価

1. 代謝物ごとに予測されたターゲットリストを、FDR < 0.05 の遺伝子レベルのDEGリストと交差させます。重複する遺伝子、由来代謝物、logFC、補正P値、および発現方向を記録してください。
2. 代謝物ごとの重複リストを統合し、冗長性のないMAGリストを作成します。予測ターゲットの総数、代謝物ごとの重複数、およびユニークなMAGの総数をカウントしてください。
3. 複数のプローブを持つ遺伝子について、プローブレベルでの方向性の一貫性を評価します。プローブ間で発現方向が一致しない遺伝子にフラグを立ててください。
4. 遺伝子レベルに集約した全エントリー数、全DEG数、全ユニーク予測ターゲット数、および観察されたMAG数を用いて、フィッシャーの正確検定用の分表を作成します。フィッシャーの正確検定を用いて、片側P値、オッズ比、および95%信頼区間を算出してください。
5. バックグラウンドのDEG率が50%を超える場合は、その重複を独立に検証された濃縮ではなく、記述的なものとして報告してください。別途方向性の検定を行わない限り、一様なダウンレギュレーションは記述的な方向性パターンとして扱ってください。

6. タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク解析およびパスウェイエンリッチメント解析

1. 完全な固有のMAGリストを、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイ濃縮解析²⁰（材料表を参照）に投入する。Homo sapiensを選択し、最小相互作用スコアを0.700に設定する。
2. 統合されたタンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイ濃縮ネットワークと、完全な相互作用テーブルをエクスポートする。テキストマイニングによってトポロジーが不自然に密集した場合は、テキストマイニングを選択解除し、実験的、共発現、およびデータベースチャネルのみを保持する。
3. SCFA関連、胆汁酸関連、およびトリプタミン/セロトニン作動性MAGについて、メタボライトクラスサブネットワークを生成する。タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイ濃縮解析の生物種および信頼度の設定は、上記と同様のものを使用する。
4. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)²¹、Reactome²²、およびGene Ontology (GO) Biological Process^23,24に対して、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイ濃縮解析を実行する。Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05を適用し、すべての濃縮テーブルをエクスポートする。

7. 分子ドッキング

1. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RCSB PDB²⁵から実験的に決定された受容体構造を取得する（Table of Materialsを参照）。優先順位の高い5つのタンパク質-リガンド複合体として、VDR/1DB1、NR1H4/FXR/3DCT、CASP3/2DKO、HTR2A/6A93を使用する。
2. 各受容体の調製において、チェーンAを保持し、水分子、共結晶化リガンド、コファクター、イオン、および非タンパク質HETATMレコードを除去する。6A93については、受容体調製の前にT4リゾチーム融合セグメントを除去する。
3. 分子構造ツールキットを用いて、極性水素の付加、Gasteiger電荷の割り当てを行い、各受容体をPDBQT形式で保存する。PDBQT変換前に結合部位のヒスチジンのプロトン化状態を確認し、選択した状態を記録する。
4. 化学構造ファイル変換ツールキットを用いて、各リガンドの3D構造を生成する。Universal Force Field (UFF) を用いて500ステップのエネルギー最小化を行い、pH 7.4のイオン化状態を割り当て、Gasteiger電荷を割り当てた後、PDBQT形式で保存する。
5. 共結晶化リガンドの重心を中心とした25 Å x 25 Å x 25 Åのドッキングボックスを定義する。中心座標は、VDRについては(10, 19, 33)、FXRについては(137, 31, 78)、CASP3については(37, 34, 32)、HTR2Aについては(12, −1, 61)とする。
6. 代謝物リガンドの標的タンパク質への分子ドッキング^26,27を、exhaustiveness = 8、seed = 42、num_modes = 9、energy_range = 3 kcal/molの条件下で実行する。すべてのポーズについて、最上位のVinaスコアおよび平方平均二乗偏差 (RMSD) 値を記録する。
7. 優先順位の高い各複合体についてモード1を選択する。分子可視化および2次元相互作用ダイアグラムツールを用いて2次元のリガンド-残基図を生成し、3次元分子可視化プログラムを用いて3次元の受容体-リガンドビューを生成する。
8. VDR/1DB1およびFXR/3DCTについて、リドッキングコントロールを行う。結晶構造のポーズに対する重原子RMSDが<2.0 Åである場合に、受容体のドッキング設定を許容する。
9. リトコール酸 (LCA) をCASP3に、トリプタミンをVDRにドッキングさせることで、クロスドッキングコントロールを行う。同族および非同族のスコアを比較し、スコア差が<1.0 kcal/molとなる例を記録する。

8. 分子動力学シミュレーション

1. CHARMM互換のリガンドパラメータ化サービス²⁸（材料表を参照）を用いて、リガンドパラメータを生成する。すべてのペナルティスコアを検査し、ペナルティが>50のパラメータをフラグ立てする。
2. 力場トポロジー変換スクリプトを用いて、リガンドのストリームファイルを分子動力学エンジン互換の.itpおよび.prmファイルに変換する。各複合体について、リガンドとタンパク質のトポロジーファイルを結合させる。
3. 分子トポロジーおよびパラメータ変換ライブラリを用いて、水素質量再分配（HMR）を適用する。分子動力学シミュレーションに使用するタンパク質力場²⁹および明示的な3サイト水モデル³⁰を用いて、水溶性トポロジーを生成する。
4. 溶質からエッジまで少なくとも1.2 nmのクリアランスを持つ十二面体ボックス内で、水溶性複合体を溶媒和させる。システムを中和し、NaClを0.15 Mまで添加する。
5. ウェブベースの膜システム構築ツール^31,32,33（材料表を参照）を用いて、トリプタミン-HTR2A膜システムを構築する。膜-タンパク質配向データベースに準拠した受容体座標³⁴（材料表を参照）、純粋なPOPC二重層、22.5 Åの水層、および0.15 M NaClを使用する。
6. 最急降下法により、最大50,000ステップまですべてのシステムのエネルギー最小化を行う。平衡化の前に、Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1で収束したことを確認する。
7. 定粒子数・定積・定温（NVT）および定粒子数・定圧・定温（NPT）アンサンブル相を用いて、水溶性システムを平衡化する。膜システムについては、拘束を段階的に解除する6ステップのウェブベース多段階分子システム準備・平衡化ワークフローを用いて平衡化を行う。
8. 5つのすべての複合体について、200 nsのプロダクションMDを実行する。水素質量再分配（HMR）を伴う4 fsのタイムステップ、310 KのV-rescaleサーモスタット、1 barのParrinello-Rahmanバロスタット、Particle mesh Ewald (PME) 静電相互作用³⁵、およびLINCS拘束³⁶を使用する。
9. 分子動力学トラジェクトリ解析ユーティリティを用いて、最終的なトラジェクトリを解析する。最後の150 nsを主要な解析ウィンドウとして、主鎖RMSD、Cα平方平均平方根変動（RMSF）、回転半径、溶媒接触表面積（SASA）、およびタンパク質-リガンド間の水素結合を算出する。

9. MM-PBSA結合自由エネルギー推定

1. MM-PBSA解析用にトラジェクトリのスナップショットを抽出する。水溶性複合体については各2,001フレームを、膜埋込型HTR2Aサブシステムについては処理済みの201フレームを使用する。
2. 分子力学／連続体溶媒結合エネルギー計算ツール³⁷を用い、ポアソン・ボルツマン溶媒和、内部誘電率 = 1、外部誘電率 = 80、SASAベースの非極性溶媒和、およびエントロピー補正なしの条件で計算を行う。平均結合自由エネルギーと標準偏差を報告する。
3. 5つのすべての複合体について、残基ごとの分解能解析を行う。絶対的な寄与度が0.5 kcalmol⁻¹以上の安定化および不安定化残基を報告する。

    

結果

代謝物関連の候補標的

化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測プログラムおよび分子ドッキングプログラムにおいて、9つの代謝物は不均一な予測ターゲットセットを生成しました。プロピオン酸、トリプタミン、胆汁酸、およびウロリチンAは、胃腸シグナル伝達への関与が知られている複数のターゲットを導出しました。予測されたターゲットの概況には、標準的な膜受容体、核内受容体、細胞内酵素、シグナル伝達タンパク質、およびペプチドホルモン関連タンパク質が含まれていました。したがって、下流の結果は受容体のみの所見ではなく、代謝物関連遺伝子（MAGs）として記述しています（表1）。

報告されているメタボライト-タンパク質相互作用によるベンチマーキング

ターゲット予測の出力を既存の実験的知見と比較してベンチマークするため、予測された代謝物関連ターゲットの関係性は、以下の3つのエビデンスレベルに分類されました：(i) 実験的に裏付けられた直接的または近接するクラスレベルの代謝物-タンパク質相互作用（当該代謝物または密接に関連する内因性代謝物が、コードされたタンパク質に結合、活性化、抑制、または機能的に調節することが報告されているもの）、(ii) パスウェイまたはターゲットクラスによって裏付けられた相互作用（予測されたターゲットが、確立された代謝物応答性パスウェイまたは受容体ファミリーに属しているが、特定の代謝物-タンパク質ペアに対する直接的な証拠が限られているもの）、および(iii) 文献レビューにおいて直接的な実験的相互作用が特定されなかった、計算上の予測のみによる関連性。このベンチマークは、予測されたMAGを検証するためではなく、その文脈を明確にするために使用されました。

いくつかの予測は、以前に報告された生物学的知見を再現していた。Propionate-FFAR2は、FFAR2/GPR43が標準的な短鎖脂肪酸受容体であるため、実験的に支持されているとみなした。Butyrate-HDAC3は、酪酸（butyrate）が既知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、予測された重複にHDACファミリーメンバーが含まれていたため、実験的またはクラス的に支持されていると分類した。NR1H4/FXRおよびVDRに関わる胆汁酸関連の予測は、確立された胆汁酸核内受容体の生物学、特にLCAなどの疎水性胆汁酸において支持されると考えられた。一方、ウルソデオキシコール酸（UDCA）に関連するFXRの予測については、UDCAが一般的に弱度の、あるいはコンテキスト依存的なFXRリガンドであるため、慎重に解釈した。トリプタミンに関連するHTR1B、HTR2A、HTR2B、およびHTR6の予測は、トリプタミンが微生物由来のトリプトファン派生モノアミンであり、セロトニン受容体が胃腸の運動性と分泌の既知の調節因子であるため、受容体特異的な直接相互作用が確認されたのではなく、セロトニン経路により支持されていると分類した。Urolithin A-CASP3は、urolithin Aとアポトーシス/カスパーゼ関連応答との間の既報の関連性から経路的に支持されると考えたが、CASP3への直接的な結合の証拠によるものではない。Indole-3-lactic acid-KYAT1およびindole-3-propionic acid-KYAT1については、微生物由来のインドール誘導体によるホストシグナル伝達は広範な文献で支持されているものの、これらの特定の代謝物による直接的なKYAT1結合は支持されていないため、計算上の仮説のみとして保持した^7,8,38,39,40。

したがって、表1では、計算によるターゲット候補の選定を、事前の実験的またはパスウェイによる支持レベルに基づいて区別しています。また、各ターゲットについて、予測ソース（化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測、分子ドッキングプログラム、またはその両方）、化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測における統合相互作用スコア、およびターゲットが分子ドッキングプログラムによって同定された場合の分子ドッキングプログラムの確率を記載しています。直接的な事前の実験的根拠がない予測ターゲットは、独立したタンパク質レベルおよびリガンド応答の検証を必要とする、候補代謝物関連遺伝子として記述されています。

予測ターゲットとIBS-Cにおいて変動的に発現した遺伝子の重複

和集合で統合した予測ターゲットリストと、遺伝子レベルでの発現変動結果を交差させたところ、IBS-Cと健康なボランティアの比較において、有意な発現変動が認められた17個のユニークな代謝物関連予測遺伝子が同定されました。これら17個の遺伝子はすべて発現が低下していました。このセットには、膜受容体および核内受容体（CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR）と、非受容体タンパク質（CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN）が含まれていました（表1、図2A,B）。

17個のMAGすべてが0.05未満の偽発見率（FDR）しきい値を満たし、17個中16個はより厳格なFDR < 0.001を満たした。残りの遺伝子（HTR1B）はFDR < 0.05で有意であった。17個のターゲットのうち7個（CASP3、GCG、GNAQ、GPHN、GPR68、HDAC3、TBXA2R）は、FDR < 0.001と、1.0を超える絶対的なlog₂ fold change（logFC範囲：−1.34〜−1.10）の両方を満たしており、このサブセットにおいて強力かつ一貫したダウンレギュレーションが示された。残りのターゲットは、中程度ではあるが統計的に有意なダウンレギュレーションを示した（|logFC|範囲：0.45〜0.97）。この一様な記述パターンについては、データセットのゲノムワイドな発現特性を考慮し、慎重に解釈した（下記の統計的評価を参照）。

ターゲットDEGのオーバーラップに関する統計的評価

17個の遺伝子の重複における統計的有意性を正式に評価するため、予測された17個の標的遺伝子をクエリセットとし、GSE36701で検出された18,296個のユニークな遺伝子崩壊エントリー（gene-collapsed entries）をゲノム背景として用い、片側フィッシャーの正確確率検定を実施した。この背景のうち、17,296個の遺伝子（94.5%）がFDR < 0.05で発現変動しており、これはIBS-C直腸粘膜の比較においてほぼ普遍的な転写抑制が起きていることを反映している。予測された17個の標的遺伝子はすべて、これら発現変動遺伝子に含まれていた（観察された重複 17/17、100%）。背景の発現変動率が94.5%であるため、ランダムに選択された任意の17個の遺伝子セットにおける期待重複数は16.1個となる。フィッシャーの正確確率検定の結果、p = 0.384であり、連続性補正オッズ比は2.03（95%信頼区間 0.12–33.73）となり、α = 0.05において統計的に有意ではなかった（図 3A–C）。

この結果は、観察された17/17の重複が、本データセットのゲノム全体の発現プロファイルにおいて偶然に予想される重複を超えていないことを示しています。したがって、これらの知見は、統計的な濃縮やゲノム背景に対する独立した検証の根拠としてではなく、予測された17個のターゲットすべてがIBS-C直腸粘膜組織において一貫して有意にダウンレギュレートされていたという、記述的な方向性のパターンとして解釈されます。正式な濃縮テストを行うには、全遺伝子の半分を大幅に下回る数のみが有意性に達するような、より選択的な差異発現プロファイルを持つトランスクリプトームデータセットでの再現性が必要です。本データセットの差異発現の背景自体が主にダウンレギュレート側であるため、重複する遺伝子間で共通の下方方向が見られることは予想されており、正式な方向性テストは実施されていないことから、重複した17個の遺伝子すべてが均一にダウンレギュレートされていることは、個別に検証された統計的結果ではなく記述的な観察であるという点を強調しておく必要があります。したがって、この均一な方向性は、協調的で代謝物特異的な調節を示す独立した統計的根拠として解釈されるべきではありません。

代謝物特異的なパターン

プロピオン酸は、CASR、FFAR2、GCG、GNAQ、GPHN、GPR68、MLN、TBXA2Rを含む、最も多くの重複遺伝子を有しており、短鎖脂肪酸応答性およびGq関連シグナリングが関与している可能性が示唆された。酪酸はHDAC3と重複しており、これは酪酸に関連するヒストン脱アセチル化酵素の生物学的機能と一致するが、mRNAのダウンレギュレーションのみでは、酪酸応答性の変化が確立されたことにはならない。胆汁酸に関連する重複には、核内受容体のVDRおよびNR1H4が含まれており、これらはいずれも腸管における胆汁酸シグナリングのエフェクターとして認識されている^38,39。トリプタミンはHTR1B、HTR2A、HTR2B、HTR6と重複し、セロトニン作動性シグナリングが候補モジュールとして関与していることが示された。このシステムは、胃腸の運動性と分泌において確立された役割を持っている⁴⁰。インドール-3-乳酸およびインドール-3-プロピオン酸はKYAT1と重複し、ウロリチンAはCASP3と重複した。

パスウェイ解析（パスウェイエンリッチメント）

特定された17個の重複遺伝子の機能濃縮解析により、Gタンパク質共役受容体（GPCR）下流シグナリング、Gαqシグナリング、GPCRリガンド結合、セロトニン作動性シナプス、神経活性リガンド-受容体相互作用、カルシウム信号伝達、cAMPシグナリング、およびペプチドホルモン分泌に関連するパスウェイが同定されました。これらの結果は遺伝子セットの構成と一致しており、その生物学的な整合性を支持していますが、これらはパスウェイレベルの活性に関する独立した証拠ではなく、提出された遺伝子の機能アノテーションを反映したものです。

タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構造

タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築およびパスウェイ濃縮分析を、3つの相補的なネットワークを用いて解釈した。17遺伝子の複合メタネットワーク（ネットワーク1）において、アノテーションにより裏付けられた最も明白な構造は、GNAQを中心とするGPCR/Gαqシグナル伝達コンポーネントであり、GNAQとTBXA2R、CASR、HTR2A、HTR2Bを含む受容体関連遺伝子とを連結していた。セロトニン受容体間の限定的な結合性も保持されており、特にHTR2AとHTR2Bの間で顕著であったが、他のいくつかの遺伝子は選択した信頼閾値において孤立しているか、あるいは弱い結合にとどまっていた。プロピオン酸特異的ネットワーク（ネットワーク2）では、より限定的なトポロジーを示し、GNAQはCASRおよびTBXA2Rへのアノテーション支持リンクを保持していた一方で、FFAR2、GPR68、GCG、GPHN、MLNは孤立しているか、あるいは弱い結合であった。トリプタミン/セロトニンネットワーク（ネットワーク3）には、HTR1B、HTR2A、HTR2B、HTR6が含まれていた。このサブセット内では、HTR2AとHTR2Bが主要なアノテーション支持結合を示したが、HTR1BとHTR6は選択した閾値において直接的に結合していなかった（図 4A–C）。

分子ドッキング

選択した5つの代謝物-タンパク質複合体について、分子ドッキングシミュレーションを実施しました。胆汁酸-核内受容体のペアは、urolithin A-CASP3およびtryptamine-HTR2Aよりも良好なVinaスコアを示しました。LCA-VDRが−10.0 kcal/molで最高のスコアとなり、次いでLCA-NR1H4/FXR（−9.9 kcal/mol）、UDCA-NR1H4/FXR（−9.4 kcal/mol）の順でした。urolithin A-CASP3とtryptamine-HTR2Aのスコアはより低かったものの、−7.1 kcal/molという妥当な値でした（表2）。

LCA-VDR複合体（PDB ID: 1DB1）において、予測ポーズは、LCAのカルボキシレート酸素とSer278との間の標準的な水素結合（4.29 Å）に加え、Leu230、Val234、Trp286、Val300、His305、Tyr295、Leu233、His397を含む広範な疎水性接触、さらにMet272、Leu313、Ile271、Ile268、Leu309、Phe422、Val418、Ala231、Ala303、Cys288、Ser275、Phe150との追加的なファンデルワールス接触によって支持されていました。上位にランクされたポーズのVinaスコアは−10.0 kcal/mol、キャビティサイズは2055 ų、グリッドセンターは(10, 19, 33)でした（表3、図5A,B）。

LCA-NR1H4/FXR複合体（PDB ID: 3DCT）において、−9.9 kcal/molのドッキングスコアとともに、His294およびIle335が関与する予測水素結合、His294とのπ-Sigma相互作用、およびMet290、Met328、Ala291、Leu287、Ile352、His447が関与する疎水的なAlkylまたはπ-Alkyl接点が見出され、さらにファンデルワールス接点がFXRポケット内へのステロイド骨格の収容を支持していた（表4、図6A,B）。

UDCA-NR1H4/FXR複合体（PDB ID: 3DCT）の予測ポーズでは、His447との標準的な水素結合（3.66 Å）、Gly322との別の水素結合（3.46 Å）、Val325とのπ-アニオン相互作用（4.96 Å）、およびTrp469との炭素-水素結合（4.51 Å）が認められました。また、相互作用マップにおいて、Arg395（3.89 Å）およびGln396（3.40 Å）との不利なドナー-ドナー接点が特定されました。このことは、同一の受容体ポケットにおいてUDCAのVinaスコアがLCAよりも低かった原因が、局所的な幾何学的構造または静電的相互作用が不適切であったためである可能性を示唆しています（表5、図7A,B）。

urolithin A-CASP3複合体（PDB ID: 2DKO）において、予測された結合様式では、Gln161（3.78および4.19 Å）、Ser120（3.95 Å）、およびArg207（3.05および3.77 Å）との従来型水素結合が特徴的であり、さらにArg207とのπ-カチオン相互作用、Cys163とのπ-ドナー水素結合、およびArg64、Ala162、His121、Ser205、Trp206が関与する追加のπ-アルキル相互作用およびファンデルワールス接触によって安定化されていた（表6、図8A,B）。

トリプタミン-HTR2A複合体（PDB ID: 6A93）において、予測されたポーズは、トリプタミンのプロトン化されたアミンと、セロトニンおよび関連受容体全般でアミン系リガンドのプロトン化アミンを固定する保存された膜貫通ヘリックス3のアスパラギン酸であるAsp155（Ballesteros-Weinstein番号ではD3.32）との間の静電的な塩橋^41,42,43によって安定化されており、さらにThr160およびSer159との水素結合、Phe340およびTrp336との芳香族接触、ならびにVal156およびIle163とのπ-Alkyl相互作用が関与していました。Tyr370、Phe339、Ser242、Phe243、Phe332、およびLeu123との追加的なファンデルワールス接触が、オーソステリックポケットへの結合パターンを支持していました（表7、図9A,B）。

ドッキングプロトコルのバリデーション

ドッキングプロトコルの信頼性を評価するため、2つの相補的なコントロール実験を行った。リドッキング（ポジティブ）コントロールでは、共結晶化リガンドをその参照X線構造から抽出し、本来の結合部位に再度ドッキングさせた。VDR/1DB1におけるビタミンDアナログVDXの予測最上位ポーズは、結晶構造上の位置から0.87 Åずれており、FXR/3DCTにおける共結晶リガンドWAY-362450は1.79 Åずれていた。どちらの値も一般的な許容閾値である2.0 Åを下回っており、これらの受容体システムにおけるドッキングプロトコルの幾何学的な妥当性が支持された（Figure 10A,B）。クロスドッキング（ネガティブ）コントロールでは、既知のリガンドではないリトコール酸をカスパーゼ-3（2DKO）というシステインプロテアーゼにドッキングさせたところ、予測スコア（−8.3 kcal/mol）は、その同族標的であるVDR（−10.0 kcal/mol）よりも1.7 kcal/mol低く、予測された結合部位選択性と一致した。トリプタミンをVDRにドッキングさせた場合の予測スコアは−6.4 kcal/molであり、同族標的であるHTR2Aでの−7.1 kcal/molと比較して0.7 kcal/molの差であった。この差は、代謝物リガンドの標的タンパク質への分子ドッキングスコアにおいて報告されている不確実性の範囲内であり、したがって、このより小さなリガンドについては予測される選択性はわずかであることを示している（Figure 10C）。総合すると、これらのコントロールは、本ドッキングプロトコルが既知の結合幾何学を再現し、試験条件下で同族ペアと同族でないペアを識別できることを示している。ただし、これらはあくまで計算上の予測であり、実験的な親和性測定に代わるものではない（Table 8）。

分子動力学シミュレーション

優先順位を付けた5つの複合体について、200 nsのプロダクション軌道で分子動力学シミュレーションを実施した。4つの水溶性および核内受容体複合体は明示的な水溶媒中でシミュレーションし、トリプタミン-HTR2A複合体は、このGタンパク質共役受容体に対して生理学的に適切な膜環境を提供するため、明示的なPOPC脂質二重層中でシミュレーションした。解析により、時間依存的条件下におけるドッキングポーズの動的安定性を検証し、複合体間での相対的な構造挙動の比較を行った(表9)。

LCA-VDR/1DB1複合体のRMSDプロファイルでは、最初の10 nsで短い平衡化期間が見られ、その後は安定したプラトーに達し、変動は主に0.20～0.28 nmの範囲内であった（図11A）。RMSF値は低く、主鎖のゆらぎは < ほとんどの残基で0.15 nm（図11B）。水素結合解析の結果、2〜5本の水素結合からなる持続的なネットワークが認められ、時折7本まで増加することが示された（図11C). 回転半径（Rg）は1.25〜1.75 nmの範囲内に維持され、溶媒接触表面積（SASA）は約130 nmに維持された。² (図 11D,E).

urolithin A-CASP3/2DKO複合体は、より高い動的活性を示しました。RMSDは初めに上昇した後、0.4から0.7 nmの間で振動し、165 ns付近で短時間の大きな偏差イベントが観察されました（図12A）。RMSF解析では、残基レベルで高い可動性が示され、特に残基175付近のフレキシブルループ領域で最大の変動が見られました（図12B）。水素結合解析により、最初の30–40 nsでは約2–5本の結合からなる広範なネットワークが形成され、その後は主に0から2本の断続的な結合に移行することが明らかになりました（図12C）。対応する回転半径およびSASAのプロファイルは、図12D,Eに示されています。

NR1H4/FXR (3DCT) 胆汁酸系において、バックボーンのRMSDプロファイルはトラジェクトリの大部分にわたって比較的狭い範囲内に留まり（図 13A）、一方でRMSFプロファイルは、コア領域で低い可動性を、柔軟な領域で高い変動を示した（図 13B）。LCA-3DCT複合体はトラジェクトリ全体を通して約3〜4本の持続的な水素結合を維持したが、UDCA-3DCT複合体はより大きな水素結合の変動を示し、約125 ns後に水素結合の減少が見られた。LCAおよびUDCA結合系の回転半径プロファイルをそれぞれ図 13C,Dに、対応するSASAプロファイルを図 13E,Fに示す。

トリプタミン-HTR2A複合体の膜分子動力学

トリプタミン-HTR2A/6A93複合体を、258個の脂質分子からなる明示的なPOPC脂質二重層、明示的な3サイト水モデル、および0.15 M NaClを含む環境下で200 nsの間シミュレーションした。全システムサイズは約100,925原子であった^33,44,45。受容体はトラジェクトリ全体を通じて二重層内に安定して埋め込まれていた（図14）。主鎖のRMSDは、最初の100 ns以内で約0.10 nmから0.15–0.20 nm付近の安定したプラトーに上昇し、その後は安定して推移し、すべての値が0.25 nm以下であった。これは、受容体が膜環境において全体的なアンフォールディングを起こさず、安定したコンフォメーションを維持していたことを示している（図15A）。残基ごとのRMSFでは、膜貫通ヘリックスコアで低い変動が示され、ループ領域および末端領域では予想通り高い可動性が見られ、これは典型的なGPCRの柔軟性と一致している（図15B）。回転半径は約2.06から2.12 nmの間に厳密に制限されており、SASAは進行性のドリフトなく狭い範囲で変動していた。これにより、コンパクトな膜貫通束が維持されていることが確認された（図15C,D）。

タンパク質とリガンド間の水素結合は、トラジェクタリー全体を通じて維持されており（図 15E）、水素結合数は1本から3本の範囲で大きく変動した。重要なイオン相互作用の持続性を具体的に評価するため、トリプタミンのプロトン化されたアンモニウム窒素とAsp155 (D3.32) のカルボキシレート酸素原子間の最小距離を、全トラジェクタリーにわたってモニタリングした。この距離は平均 0.270 nm（最小 0.247 nm、最大 0.424 nm）付近に密に分布しており、ソルトブリッジの接触（< 0.4 nm）は、2回の短時間の逸脱があったのみで、シミュレーションの99.9%の間維持され、持続的な解離イベントは見られなかった（図 16）。これらの結果は、保存されたAsp155とのイオン相互作用が、膜シミュレーションを通じてHTR2Aのオルソステリックポケット内でトリプタミンを安定化させるのに十分であったことを示唆している。

MM-PBSA結合自由エネルギーおよび残基別分解解析

5つの複合体にさらなるエネルギー的な優先順位付けの層を加えるため、MM-PBSA解析を実施した（Table 10）。4つの水溶性複合体について、残基ごとの分解解析により、予測された各結合モードにおける主要なエネルギー寄与因子を特定した。LCA-VDR/1DB1複合体では、リガンドとGln317が有利な寄与を示した一方、Trp286は不利な寄与を示した。urolithin A-CASP3/2DKO複合体では、Arg64とArg207が強い負の残基別寄与を示し、実質的な極性または静電的な安定化が示唆された。それにもかかわらず、対応するトラジェトリは非常にダイナミックなままであり、残基レベルでの有利なエネルギー論だけでは、複合体の持続的な安定性は保証されないことが示された。3DCTシステムでは、LCAの結合は主にArg331によって駆動されていたが、UDCAの結合はGlu326、Asp394、Arg395、Arg441、およびAsp470からなる、より分散したエネルギーネットワークに関与していた。4つの水溶性システム全体を通して、MM-PBSA分解解析はLCAベースの複合体の相対的な優先順位を支持する結果となった。

膜埋込型のtryptamine-HTR2A/6A93複合体について、二層膜トラジェクトリから抽出したタンパク質-リガンドサブシステムに対してMM-PBSA解析を行った^46,47。その結果、リガンドおよびAsp155 (D3.32) に好ましい寄与が認められ、特にAsp155は残基レベルで圧倒的に支配的な安定化寄与を示した。これは、ドッキング解析およびトラジェクトリの距離解析の両方で同定された塩橋相互作用と一致している。一方、結合ポケットを裏付ける芳香族および極性接触ネットワークを形成する周囲のオーソステリックポケット残基（Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171）の中では、Trp137が残基あたりで最大の不利な寄与を示した。これらの値は構造的な優先順位付けのための相対的な計算上の推定値であり、実験的な結合親和性を示すものではない。

図 1: IBS-Cにおける代謝物関連宿主遺伝子の優先順位付けのための計算ワークフロー。 代謝物の選択、ターゲット予測、トランスクリプトームの差分発現、オーバーラップ解析、ネットワークおよびパスウェイ濃縮解析、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、およびMM-PBSA結合自由エネルギー解析を統合した8段階のワークフローの概略図。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 2: IBS-C粘膜における差分的発現および代謝物ターゲットの重複解析。(A) GSE36701における遺伝子レベルの差分的発現のボルケーノプロット。青色の点は有意にダウンレギュレートされた遺伝子、赤色の点は有意にアップレギュレートされた遺伝子、灰色の点は有意ではない遺伝子を示す。選択された重複する代謝物関連遺伝子がラベル付けされている。(B) 330個のユニークな予測代謝物ターゲットとGSE36701におけるダウンレギュレートされた遺伝子との重複を示すベン図。17個の遺伝子が共通していた。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 3: GSE36701を用いた、予測された17個の代謝物標的遺伝子の統計的評価。(A) 全17遺伝子の遺伝子ごとのlog2 fold change。有意性の階層に基づいて色分けされている。(B) フィッシャーの正確検定による、背景遺伝子と予測標的遺伝子の差分的発現率。(C) フィッシャーの正確検定に使用される2×2の分割表。17個の標的すべてが有意にダウンレギュレートされていた。この重複は、統計的な濃縮ではなく、記述的な方向性パターンとして解釈される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 重複する代謝物関連遺伝子の複合タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイエンリッチメントタンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク。 (A) ネットワーク 1：全 17 遺伝子の統合メタネットワーク。(B) ネットワーク 2：8 つの遺伝子（CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R）からなるプロピオン酸特異的ネットワーク。(C) ネットワーク 3：4 つの遺伝子（HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6）からなるトリプタミン/セロトニンネットワーク。ネットワークは、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイエンリッチメントの信頼度 ≥ 0.700 を用いて、最低限 Homo sapiens で生成された。エッジはアノテーションによって支持された機能的関連性を表す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 5: VDR (PDB ID: 1DB1) と複合体を形成したリトコール酸の3次元および2次元構造表現。(A) リトコール酸を球状で示した3次元表面およびカートゥーン表現。(B) Ser278の水素結合と、周囲の疎水性およびファンデルワールス接触を示す2次元相互作用マップ。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図6. NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) と複合体を形成したリトコール酸の三次元および二次元構造表現。(A) 三次元表面およびカートゥーン表現。 (B) His294 および Ile335 との水素結合、π-Sigma相互作用、および周囲のコンタクトを示す二次元相互作用マップ。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 7: NR1H4/FXR（PDB ID: 3DCT）と複合体を形成したウルソデオキシコール酸の三次元および二次元構造表現。(A) 三次元の表面およびカートゥーン表現。(B) His447およびGly322との水素結合、Val325とのπ-アニオン相互作用、Trp469との炭素-水素結合、およびArg395とGln396との不利なドナー-ドナー接点を示す二次元相互作用マップ。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 8: CASP3 (PDB ID: 2DKO) と複合体を形成した urolithin A の3次元および2次元構造表現。(A) 3次元表面およびカートゥーン表示。(B) Gln161, Ser120, Arg207 との水素結合、Arg207 との π-カチオン相互作用、Cys163 との π-ドナー水素結合、および周囲のコンタクトを示す2次元相互作用マップ。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図9: HTR2A（PDB ID: 6A93）と複合体を形成したトリプタミンの3次元および2次元の構造表現。(A) 3次元分子可視化プログラムで作成された3次元表面およびカートゥーン表現。(B) 分子可視化および2次元相互作用図作成ツールで作成された2次元相互作用マップであり、Asp155の塩橋およびその他の結合部位における相互作用を示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 10: ドッキングプロトコルのバリデーション。(A,B) VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) および FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å) への共結晶化リガンドの再ドッキング。結晶構造のポーズと再ドッキングしたポーズを重ね合わせており、いずれも許容閾値である 2.0 Å を下回っている。(C) クロスドッキング選択性：リトコール酸およびトリプタミンの、同族および非同族の Vina スコア。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 11. 200 nsにわたるLCA-VDR/1DB1複合体の分子動力学トラジェクトリ解析。(A) RMSDプロファイル。 (B) RMSFプロファイル。 (C) 水素結合数。 (D) 慣性半径プロファイル。 (E) SASAプロファイル。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 12: 200 nsにおけるurolithin A-CASP3/2DKO複合体の分子動力学トラジェクトリ解析。(A) 広範なコンフォメーション変動と、165 ns付近での一過性の大きな偏差イベントを示すRMSDプロファイル。(B) 残基175付近で顕著な残基レベルの柔軟性を示すRMSFプロファイル。(C) 水素結合数。(D) 回転半径プロファイル。(E) SASAプロファイル。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図13: 200 nsにおけるNR1H4/FXR (3DCT) 胆汁酸系の分子動力学トラジェクトリ解析。(A) 3DCT複合体の主鎖RMSDプロファイル。(B) 主鎖RMSFプロファイル。(C) 3DCT-LCAの回転半径（Radius-of-gyration）プロファイル。(D) 3DCT-UDCAの回転半径プロファイル。(E) 3DCT-LCAのSASAプロファイル。(F) 3DCT-UDCAのSASAプロファイル。こちらのリンクをクリックして、本図の拡大版を表示してください。

図14: 明示的なPOPC脂質二重層に埋め込まれたトリプタミン-HTR2A複合体。受容体は二重層を貫通するリボンモデルで、POPC脂質はリン酸頭部を強調した線として、トリプタミンはオルステリックポケット内に示されている。水は膜の上方および下方に示されている。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

Figure 15: 明示的POPC脂質二重層におけるtryptamine-HTR2A/6A93複合体の200 nsにわたる分子動力学トラジェクトリ解析。(A>) バックボーンRMSDプロファイル。 (B>) 残基ごとのRMSFプロファイル。 (C>) 回転半径プロファイル。 (D>) SASAプロファイル。 (E>) タンパク質-リガンド間の水素結合数。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 16: 200 nsの膜トラジェトリーにおけるトリプタミン–Asp155 (D3.32) イオン相互作用の持続性。 トリプタミンのアンモニウム窒素とAsp155のカルボキシレート酸素原子の間の最小距離を時間に対してプロットしたものである。破線は0.4 nmのソルトブリッジ接触閾値を示す。この接触はシミュレーションの99.9%の間維持されていた。こちらのリンクから、この図の拡大版を表示できます。

遺伝子シンボル	由来代謝物	機能カテゴリー	log2FC	FDR (補正 P値)	有意性ティア
GCG	プロピオン酸	ペプチドホルモン関連タンパク質	−1.342	1.97e−7	FDR <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	酪酸	酵素	−1.234	2.44e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	ウロリチンA	酵素	−1.198	6.66e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	プロピオン酸	膜受容体	−1.137	4.35e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	プロピオン酸	細胞内シグナル伝達タンパク質	−1.122	1.05e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	プロピオン酸	その他細胞内タンパク質	−1.109	1.13e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	プロピオン酸	膜受容体	−1.104	4.04e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	トリプタミン	膜受容体	−0.967	2.17e−5	FDR <0.001
VDR	リトコール酸	核内受容体	−0.942	5.73e−7	FDR <0.001
HTR2A	トリプタミン	膜受容体	−0.937	4.99e−6	FDR <0.001
FFAR2	プロピオン酸	膜受容体	−0.889	1.44e−4	FDR <0.001
NR1H4	リトコール酸 / ウルソデオキシコール酸	核内受容体	−0.861	3.68e−6	FDR <0.001
HTR2B	トリプタミン	膜受容体	−0.702	1.29e−4	FDR <0.001
MLN	プロピオン酸	ペプチドホルモン関連タンパク質	−0.605	7.39e−5	FDR <0.001
KYAT1	インドール-3-乳酸 / インドール-3-プロピオン酸	酵素	−0.530	3.61e−4	FDR <0.001
CASR	プロピオン酸	膜受容体	−0.483	4.05e−4	FDR <0.001
HTR1B	トリプタミン	膜受容体	−0.455	3.18e−2	FDR <0.05

表1：IBS-C直腸粘膜データセットにおける差分発現遺伝子と重複する、予測されたメタボライト関連標的遺伝子。 リストされたすべての重複遺伝子はダウンレギュレートされていた。表1はスプレッドシートとして別途提出されており、各標的に対して、由来するメタボライト、機能カテゴリー、標的予測ソース（化学物質-タンパク質相互作用標的予測、分子ドッキングプログラム、またはその両方）、化学物質-タンパク質相互作用標的予測の統合相互作用スコア、および（利用可能な場合は）分子ドッキングプログラムの確率、予測ティア、log2 fold change、および発現有意性ティアを伴うFDRが記載されている。ソース：遺伝子発現値は、遺伝子集約済みGSE36701差分発現テーブル（遺伝子あたり最低FDRのプローブ）から取得した。標的予測ソースおよび信頼度値は、化学物質-タンパク質相互作用標的予測と分子ドッキングプログラムの出力から、化学物質-タンパク質相互作用標的予測統合相互作用スコア ≥ 0.700および分子ドッキングプログラム確率 ≥ 0.70の閾値を用いてまとめた。化学物質-タンパク質相互作用標的予測スコアは0～1スケールの統合スコアであり、STPは分子ドッキングプログラムの確率を示す。ティア1 = 化学物質-タンパク質相互作用標的予測による厳格な支持、ティア1+ = 分子ドッキングプログラムによって相互支持された化学物質-タンパク質相互作用標的予測による厳格な支持。

複合体	タンパク質 (PDB ID)	リガンド	Vinaスコア (kcal/mol)	キャビティサイズ (Å^3)	グリッド中心 X,Y,Z (A)	検索ボックス (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	リトコール酸	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	リトコール酸	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	ウルソデオキシコール酸	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
ウロリチンA-CASP3	CASP3 (2DKO)	ウロリチンA	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
トリプタミン-HTR2A	HTR2A (6A93)	トリプタミン	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

表2：分子ドッキング結果：優先順位付けされた5つのタンパク質-リガンド複合体における、標的タンパク質への代謝物リガンドの分子ドッキングの上位スコアおよびキャビティパラメータ。キャビティサイズはųで表記。出典：Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx、シート「Original_Docking_Scores」。標的タンパク質への代謝物リガンドの分子ドッキング；exhaustive=8、seed=42（固定）、num_modes=9（すべての複合体共通）；最上位（モード1）のポーズを報告。

相互作用の種類	残基	距離 (A)	備考
従来の水素結合	Ser278	4.29	LCAカルボキシレート酸素
疎水性 / Pi-アルキル接触	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
ファンデルワールス接触	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

表3：VDR（PDB ID: 1DB1）へのリトコール酸ドッキングによって生成された結合モード。出典：分子視覚化および2次元相互作用図ツールによる2次元リガンド-残基相互作用図（原稿の「結果（分子ドッキング）」に記載）。「-」は、その接点について距離値が個別に報告されなかったことを示す。

相互作用の種類	残基	距離 (A)	備考
水素結合	His294	-
水素結合	Ile335	-
π-σ相互作用	His294	-
アルキル / Pi-アルキル（疎水性）	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
ファンデルワールス接触	追加のポケット残基（ソース内では個別に指定されていない）	-	ステロイド骨格の収容を支持する

表4：NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) とのリトコール酸ドッキングで生成された結合モード。

出典：分子視覚化および二次元相互作用ダイアグラムツール。原稿の「Results (Molecular docking)」に記載されている2Dリガンド-残基相互作用ダイアグラム。 「-」は、そのコンタクトに対して距離値が個別に報告されなかったことを示す。

相互作用の種類	残基	距離 (A)	備考
慣習的な水素結合	His447	3.66
水素結合	Gly322	3.46
π-アニオン相互作用	Val325	4.96
炭素-水素結合	Trp469	4.51
不利なドナー-ドナー接触	Arg395	3.89
不利なドナー-ドナー接触	Gln396	3.40

表5：NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) とウルソデオキシコール酸とのドッキングにより生成された結合様式。出典：分子視覚化および2次元相互作用ダイアグラムツールによる2次元リガンド-残基相互作用ダイアグラム（原稿の「結果（分子ドッキング）」に記載）。「-」は、その接点について距離の値が個別に報告されなかったことを示す。

相互作用のタイプ	残基	距離 (A)	注意事項
標準的な水素結合	Gln161	3.78
標準的な水素結合	Gln161	4.19	2回目のコンタクト
慣習的な水素結合	Ser120	3.95
従来型水素結合	Arg207	3.05
従来の水素結合	Arg207	3.77	二次接触
π-カチオン相互作用	Arg207	-
πドナー水素結合	Cys163	-
π-アルキル相互作用 / ファンデルワールス接点	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

表6：CASP3 (PDB ID: 2DKO) とのウロリチンAドッキングにより生成された結合様式。出典：原稿の結果（分子ドッキング）で報告されている、分子可視化および二次元相互作用ダイアグラムツールによる2Dリガンド-残基相互作用ダイアグラム。「-」は、その接点について距離値が個別に報告されていないことを示す。

相互作用の種類	残基	距離 (A)	注意点
静電塩橋	Asp155 (D3.32)	-	トリプタミンのプロトン化アミン
水素結合	Thr160	-
水素結合	Ser159	-
芳香族接触	Phe340, Trp336	-
π-アルキル相互作用	Val156, Ile163	-
ファンデルワールス接触	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

表7：HTR2A (PDB ID: 6A93) とのトリプタミン・ドッキングにより生成された結合モード。出典：論文の「結果（分子ドッキング）」に記載された、分子視覚化および2次元相互作用図作成ツールによる2次元リガンド-残基相互作用図。「-」は、その接点について距離値が個別に報告されなかったことを示す。

(A) リドッキング検証（ポジティブコントロール）
PDB ID	タンパク質	共結晶リガンド	Vinaスコア (kcal/mol)	RMSD (A)	閾値 (A)	結果
1DB1	VDR	VDX (ビタミンDアナログ)	−13.0	0.87	2.0	合格
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	合格
(B) クロスドッキング検証（ネガティブコントロール）
リガンド	同族標的 (PDB)	同族スコア (kcal/mol)	非同族標的 (PDB)	非同族スコア (kcal/mol)	デルタ (kcal/mol)	選択性
リトコール酸	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	確認済み
トリプタミン	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	限定的 (Vinaの不確かさ +/−0.5–1.0 の範囲内)

表8：ドッキングプロトコルの検証結果：リドッキングのRMSD値（ポジティブコントロール）およびクロスドッキングスコア（ネガティブコントロール）。出典：Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsxおよびDocking_Validation/Logs/*.log（代謝物リガンドの標的タンパク質への分子ドッキング、exhaustiveness = 8、seed = 42、25 Å × 25 Å × 25 Å ボックス）。RMSDは重原子および原子名の一致により算出（重ね合わせなし）。

複合体	RMSD (nm)、平均値 ± 標準偏差 (範囲)	Rg (nm), 平均値 ± 標準偏差 (範囲)	SASA (nm^2)、平均値 ± 標準偏差（範囲）	水素結合数、平均 + / –標準偏差（範囲）	RMSF (nm)、平均（最大）
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093（残基120において最大0.600）
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (最大 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (最大 0.298)
ウロリチンA-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172（175番目の残基で最大 2.532）
トリプタミン-HTR2A/6A93（膜）	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090（最大 0.319）

表9：膜埋め込みトリプタミン-HTR2Aシステムを含む、優先順位付けされた5つのタンパク質-リガンド複合体の200 ns分子動力学シミュレーション挙動の要約。出典：プロトコルステップ8.8に従い、各200 nsのプロダクションランの最終150 ns（50–200 ns）にわたって計算された分子動力学トラジェクタリー解析ユーティリティ（.xvg）ファイル（gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf）。RMSD/Rgは主鎖にフィッティング。SASAプローブ半径 0.14 nm。H-bondドナー-アクセプター遮断値 0.35 nm / 30 °。LCA-3DCTとUDCA-3DCTは、1つのタンパク質主鎖トラジェクタリー（RMSD, RMSF）を共有し、リガンド特有のRg/SASA/H-bondsを有する。

Tryptamine-HTR2A/6A93（膜） — 残基ごとの定量的分解
残基	全ddG寄与（kcal/mol）、平均値 ± 標準偏差（SD）	方向
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	安定化（優性）
トリプタミン（リガンド）	−13.01 + / − 6.22	安定化
Tyr171	13.62 + / − 4.54	不安定化
Val167	23.32 + / − 3.96	不安定化
Val156	20.03 + / − 3.81	不安定化
Thr160	4.86 + / − 3.64	不安定化
Ser159	24.16 + / − 3.48	不安定化
Ser86	24.48 + / − 3.65	不安定化
Phe87	35.18 + / − 4.04	不安定化
Phe133	32.80 + / −3.70	不安定化
Phe140	30.63 + / − 3.84	不安定化
Phe141	35.25 + / − 3.55	不安定化
Ile163	27.64 + / − 3.71	不安定化
Trp137	53.77 + / − 4.32	不安定化（最大不利）
その他の4つの複合体 — 残基別分解（定性的）で特定された残基
複合体	残基	方向
LCA-VDR/1DB1	リガンド (LCA)	良好な
LCA-VDR/1DB1	Gln317	良好な
LCA-VDR/1DB1	Trp286	不適切
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	良好（優性）
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	混合型/分散型ネットワーク
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	混合/分散型ネットワーク
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	混合/分散ネットワーク
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	混合/分散型ネットワーク
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	混合/分散ネットワーク
ウロリチンA-CASP3/2DKO	Arg64	強い親和性（極性／静電的）
ウロリチンA-CASP3/2DKO	Arg207	非常に好ましい（極性／静電的）

表10：残基ごとのMM-PBSA分解 短縮要約：膜埋込型tryptamine-HTR2Aシステムを含む、優先的に選定された5つのタンパク質-リガンド複合体のそれぞれについて、安定化および不安定化に寄与する残基（絶対寄与度が0.5 kcal mol⁻¹以上）。出典：Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat（分子力学/連続溶媒結合エネルギー計算ツールGeneralized Born (GB) 残基ごとの分解、「Complex: Total Energy Decomposition」）。残基番号は、CHARMM-GUIで構築したシステムの内部番号（オフセット+68）から、本原稿の他箇所で使用している元の6A93 PDB番号に変換されている。

出典：Previous_MD Simulation data/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg および原稿の結果（MM-PBSA結合自由エネルギーおよび残基別分解）。これら4つの複合体については、プロジェクトディレクトリ内に数値による残基別 .dat/.csv 出力が存在しません（機械的に抽出不可能なベクトルパス形式のテキストを含むSVGプロットのみが存在します）。原稿の本文に記載されている通り、残基の同一性と有利・不利な方向のみが報告されています。これら4つの複合体の正確な kcal/mol 寄与度は、ソースリポジトリでは入手不可能です。

ディスカッション

この探索的な計算研究では、微生物代謝物に関連するホスト遺伝子およびタンパク質-リガンド複合体を優先順位付けするための、統合的で再現可能なワークフローを実証しており、ここでは公開されているIBS-C直腸粘膜トランスクリプトームデータセットに適用しています。このワークフローを用いることで、予測された微生物代謝物関連遺伝子のサブセットが、データセット内で一貫して発現低下している遺伝子と重複し、GPCR、セロトニン作動性、カルシウムシグナリング、神経活性リガンド受容体、および核内受容体に関連するパスウェイにクラスター化することが示されました。これらのシステムは、微生物叢とホストのコミュニケーションへの関与がますます指摘されています^48,49。これらの知見は、厳密に仮説生成として解釈されるべきです。本解析では、微生物代謝物濃度、受容体タンパク質量、リガンド結合、受容体活性化、ダウンストリームシグナリング、運動能、分泌、疼痛反応、または臨床転帰を測定していません。支持可能な最も強力な結論は、特定された遺伝子とパスウェイが、確定した疾患メカニズムではなく、実験的検証の候補であるということです。

単一の代謝物と受容体のペアを個別に検討した従来の研究に対し、本プロトコルの極めて重要な意義は、ターゲット予測、公開トランスクリプトームデータ、ネットワーク解析、バリデーションコントロールを伴うドッキング、分子動力学シミュレーション、およびMM-PBSAを、単一の連続的な優先順位付けパイプラインに統合した点にある。各段階で、前段階によって生成された候補セットを絞り込み、文脈化しており、この連続的なフィルタリングによって、最終的な候補リストを実験的に扱い可能な範囲にまで落とし込むことができる。ここで同定されたGNAQ中心のGPCRモジュールおよびセロトニン受容体関連モジュールは、ホスホリパーゼCの活性化、イノシトール 1,4,5-三リン酸の産生、カルシウム動員、分泌、および腸内分泌機能におけるGqシグナリングの役割、ならびに粘膜恒常性における短鎖脂肪酸およびトリプトファン由来シグナリングの既知の役割、そして胃腸運動、分泌、内臓感度、および腸脳相関におけるセロトニン作動性シグナリングの既知の役割を考慮すると、生物学的に妥当である^10,18,50,51。

本研究における重要な手法上の特徴は、膜埋め込み型受容体HTR2Aの処理にあります。可溶相シミュレーションでは、Gタンパク質共役受容体のコンフォメーション挙動を支配する脂質環境を再現できないため、トリプタミン-HTR2A複合体は明示的なPOPC二重層中でシミュレーションされました。この膜環境において、受容体は200 nsの全トラジェクトリを通じて構造的に安定しており、トリプタミンのアンモニウム基とAsp155 (D3.32) の塩橋は、実質的にシミュレーション全体にわたって維持されました。ドッキングポーズ、トラジェクトリを通じた持続的な接触距離、および残基ごとの主要なMM-PBSA寄与という3つの独立した証拠が、同一の保存されたD3.32相互作用に収束していることは、予測されたトリプタミンの結合モードに内部一貫性を与えており、これはセロトニン受容体におけるアミン系リガンドの正統な結合幾何学を再現しています。

このワークフローを再現する際には、考慮すべきいくつかの方法論的な問題があります。標準構造における誤りや、Pan-assay interference compounds ((PAINS))としてフラグが立てられた化合物によるエラーは、ターゲット予測およびドッキングを通じて伝播するため、正確な代謝物の選択とケモインフォマティクスによるキュレーションが必要です。信頼性基準を一貫して適用することで、ノイズ主導のターゲットセットを最小限に抑えてください（化学物質-タンパク質相互作用ターゲット予測：≥0.700、分子ドッキングプログラム：≥0.70、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築およびパスウェイ濃縮分析：≥0.700）。予測されたターゲットは、すべての代謝物関連遺伝子を受容体として誤認することを避けるため、機能カテゴリーごとにグループ化する必要があります。PDB構造の精密な前処理、リガンドのエネルギー最小化、および既知の結合残基周囲へのグリッド配置はドッキングにおける不可欠な要素であり、本手法で導入したリドッキングおよびクロスドッキングのコントロールは、ドッキング手法の正当性を客観的に評価する指標となります。分子動力学における再現性の範囲は、力場パラメータ化、適切な溶媒和または膜構築、段階的な平衡化、および適切なプロダクションサンプリングの組み合わせによって定義されます。

一般的な適応策およびトラブルシューティングの手順としては、ターゲット予測でヒットが得られない場合に閾値を緩和すること、複数のプローブを持つ遺伝子についてプローブレベルでの方向性の一貫性を確認すること、および、孤立したタンパク質相互作用ネットワーク構築とパスウェイ解析のノードを、生物学的に無関係であると見なすのではなく、閾値に依存していると解釈することなどが挙げられます。膜受容体については、ここで説明するHTR2Aの手法に示されているように、水溶液シミュレーションではなく、明示的な脂質二重層シミュレーションを使用する必要があります。残基ごとのエネルギー分解が必要な場合は、分解可能なエンジンで計算を行う必要があり、報告される残基番号は、曖昧さを避けるためにネイティブ受容体の番号と整合させる必要があります。パスウェイ解析の結果は、パスウェイレベルでの検証としてではなく、候補リストの整理上のコンテキストとして扱うのが最適であると考えられます。メカニズムとしては、タンパク質レベルの共調節にかかわらず、遺伝子リストに複数のセロトニン受容体遺伝子が含まれている場合はいつでも、GPCR、セロトニン作動性、またはカルシウムシグナル伝達の項目の濃縮が起こります。膜埋込型のHTR2AシステムのRMSD、Rg、およびRMSFの値は、脂質二重層を考慮して解釈する必要があります。後期のトラジェクトリーにおけるRgの減少は、全体のアンフォールディングではなく、二重層に起因する膜貫通束のコンフォメーション適応を反映している可能性があり、持続的なリガンド-タンパク質間の水素結合は、全体のRMSDの安定性と併せて解釈すべきです。

本研究には重大な限界があり、解釈を制約するものである。研究は相対的に小規模な1つの公開データセットに基づいており、主要な公開トランスクリプトームリポジトリ（ウェブベースの差分的遺伝子発現解析ツールおよびArrayExpress）を検索したが、解析時点で複製コホートとして利用可能な、同等の設計およびプラットフォームを持つ独立したIBS-C直腸粘膜トランスクリプトームデータセットは特定されなかった。独立したトランスクリプトームによる再現性の確認がなされていないことは大きな限界であり、本稿のいかなる記述も、単一データセットによる知見の外部妥当性を検証したものと解釈されるべきではない。このデータセットでは、ほぼ普遍的な差分的発現（約94.5%の遺伝子が有意であり、その大部分がダウンレギュレートされている）が見られ、この特性により従来の濃縮統計では有益な情報を得られず、ゲノム背景に対する標的遺伝子のダウンレギュレーションの特異性について結論を出すことができない。したがって、重複は統計的な濃縮ではなく、記述的な方向性パターンとして報告されている。バルク粘膜トランスクリプトーム解析では、実際の遺伝子制御と細胞組成の変化を区別することはできない。mRNAの発現量は、タンパク質の量や機能的応答を決定するものではない。標的予測データベースはアノテーションバイアスの影響を受けており、ドッキング、MD、およびMM-PBSAの結果は、力場の選択、リガンドのパラメータ化、開始位置、シミュレーション時間、およびサンプリングの妥当性に依存する。CHARMM互換リガンドパラメータ化サービス、CHARMM-GUI、統計計算環境を含む一部のウェブサーバーおよびパッケージコンポーネントの正確なマイナー/ビルド識別子は不詳である

パッケージのビルドおよび分子力学/連続体溶媒結合エネルギー計算ツールのサブバージョンは、アーカイブされたプロジェクト記録から完全に復元できなかったため、個別の材料一覧表に記載されているものとして報告されるべきです。MM-PBSA値は相対的な推定値であり、明示的な構成エントロピー項を含まないため、実験的な親和性として解釈してはなりません。本研究ではメタボロームデータが不足しており、IBS-Cにおいてリガンドの利用可能性が変化しているか、あるいは観察された発現変化が原因、結果、代償反応、または無関係な相関であるかを判断することはできません。

本手法の今後の展望としては、独立したトランスクリプトーム複製、定量PCR（qPCR）およびタンパク質レベルでの検証、シングルセルまたは空間トランスクリプトミクスによる細胞型局在の特定、関連する代謝物クラスのメタボロームプロファイリング、ならびに患者由来コロノイド、粘膜外植片、または同等のモデルを用いた機能的なリガンド応答アッセイなどが挙げられます。下痢型IBS、混合型IBS、炎症性腸疾患、およびIBS以外の便秘症コホート^1,2との比較を行うことで、疾患特異性の確立に寄与すると考えられます。構造解析コンポーネントに関しては、MDトラジェクトリの複製、代替的な開始ポーズを用いた感度分析の実施、およびトポロジー、トラジェクトリ、MM-PBSAの入力・出力ファイルのデポジションに関する完全な文書化を行うことで、再現性をさらに強化できます。優先順位付けされた複合体が機能的に関連しているかどうかを判断するには、実験的なリガンド応答アッセイが引き続き必要であり、本結果は臨床的または治療的な主張を支持するものではありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AutoDock Vina	Scripps Research / オープンソース	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	標的タンパク質への代謝物リガンドの分子ドッキング。
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / メリーランド大学	v4.6; https://cgenff.com/	分子動力学のためのリガンド力場パラメータ化。
CHARMM36m force field	CHARMM開発チーム / オープンソース	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	分子動力学シミュレーションに使用されるタンパク質力場。
CHARMM-GUI Membrane Builder	CHARMM-GUI / リーハイ大学	Webサーバー; 正確なリリースバージョンは不明; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	明示的POPC膜システムの構築および平衡化セットアップ。
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	二次元のリガンド-残基相互作用解析。
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	Webツール; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	GSE36701の差異発現解析。
GeneCards	ワイツマン科学研究所	Webデータベース; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.genecards.org/	標的標準化における遺伝子シンボルおよび遺伝子情報の検証。
gmx_MMPBSA	オープンソース (Valdés-Tresanco et al.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	MM-PBSA結合自由エネルギー推定および残基ごとの分解。
GROMACS	GROMACS開発チーム / オープンソース	2024.2; https://www.gromacs.org/	分子動力学シミュレーションエンジン。
GSE36701 transcriptomic dataset	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	公開IBS-C直腸粘膜発現データセット。
Open Babel	オープンソース	3.2.0; https://openbabel.org/	化学ファイル形式の変換、三次元リガンドの生成、およびリガンドの調製。
OPM database	ミシガン大学	Webデータベース; 2026年1月-5月にアクセス; https://opm.phar.umich.edu/	HTR2Aのアライメントに使用されたOrientation of Proteins in Membranes座標。
ParmEd	ParmEd開発チーム / オープンソース	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	水素質量再分配および分子シミュレーション・トポロジー処理。
PyMOL	Schrödinger / オープンソース	2.x; https://www.pymol.org/	三次元構造の視覚化および受容体-リガンド図の作成。
RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	Webデータベース; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.rcsb.org/	実験的タンパク質構造およびPDB座標のソース。
STITCH	STITCHコンソーシアム (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	化学物質-タンパク質相互作用の標的予測。
STRING	STRING Consortium / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築およびパスウェイ濃縮解析。
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / ローザンヌ大学	Webツール; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.swissadme.ch/	化学情報学的記述子、薬物動態予測、およびPAINS評価。
SwissTargetPrediction	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / ローザンヌ大学	Webツール; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.swisstargetprediction.ch/	リガンドに基づくヒトタンパク質標的の予測。
UniProt ID Mapping	UniProt Consortium	Webサービス; 2026年1月-5月にアクセス; https://www.uniprot.org/id-mapping	タンパク質識別子の標準化されたHGNC承認遺伝子シンボルへのマッピング。
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/ドライババージョンは原稿に記載なし	分子動力学シミュレーションに使用されたCUDA対応グラフィックス処理装置。
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	CUDAツールキットバージョンは原稿に記載なし; ≥8 GB VRAM	≥8 GB VRAMを備えたCUDA対応GPU。ワークステーションには≥32 GB RAMおよび6コアCPUも必要であった。
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / オープンソース	22.04 LTS	64ビットLinuxオペレーティングシステム。
Python 3.9	Python Software Foundation	3.9	ワークフローのスクリプティングおよび解析に使用された汎用プログラミング環境。
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI / 米国国立医学図書館	公開Webリポジトリ; ソフトウェアバージョンは原稿に記載なし	公開機能ゲノミクスデータリポジトリ。
AutoDockTools/MGLTools	Molecular Graphics Laboratory, Scripps Research	1.5.7	分子構造およびドッキング入力調製ツールキット。
GROMACS analysis tools	GROMACS開発チーム / オープンソース	2024.2	分子動力学トラジェクタリ解析ユーティリティ。
CHARMM-GUI six-step protocol	CHARMM-GUI / リーハイ大学	Webプロトコル; 正確なリリースバージョンは不明	Webベースの多段階分子システム調製および平衡化ワークフロー。
cgenff_charmm2gmx_py3.py	オープンソース変換スクリプト; ソースは原稿に記載なし	バージョンは原稿に記載なし	力場トポロジー変換スクリプト。
Python	Python Software Foundation	3.9	汎用プログラミング環境。
SciPy	SciPyコミュニティ / オープンソース	バージョンは原稿に記載なし	科学計算ライブラリ。
scipy.stats.fisher_exact	SciPyコミュニティ / オープンソース	SciPyバージョンは原稿に記載なし	フィッシャー’s正確検定の実装。
R	R Foundation for Statistical Computing	4.3.x	統計計算環境。
Bioconductor	Bioconductorプロジェクト / オープンソース	3.18	バイオインフォマティクスソフトウェアフレームワーク。
limma	Bioconductorプロジェクト / オープンソース	バージョンは原稿に記載なし	差異遺伝子発現解析パッケージ。
Benjamini–Hochberg procedure	統計手法	該当なし（統計的手順）	偽発見率調整法。
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/ドライババージョンは原稿に記載なし	少なくとも8 GBのビデオメモリを備えたグラフィックス処理装置。
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	CUDAツールキットバージョンは原稿に記載なし; ≥8 GB VRAM	汎用並列計算をサポートするグラフィックス処理装置。
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / オープンソース	22.04 LTS	64ビットLinuxオペレーティングシステム。
TIP3P	CHARMM力場開発チーム / オープンソース	TIP3P; 適用されるソフトウェアバージョンなし	3サイト明示的水モデル。
MM/PBSA	gmx_MMPBSA開発チーム / オープンソース	gmx_MMPBSA 1.5.x	分子力学/ポアソン–ボルツマン表面積結合エネルギー法。