計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

C. elegansの寿命を測定するために、タイミングを合わせた卵産出により、年齢が同期した集団を作成します。活性のある成体雌雄同体虫を、UV殺菌したE. coliを播種したnematode growth media（NGM）プレートに移動させ、6〜8時間卵を産ませた後、次の2日間にわたって虫を除去します。これらの卵から虫が孵化し、L4幼虫期まで成長します。L4虫を、生菌による汚染を防ぐためのampicillinおよび生殖を防ぐためのFUDRを含む新しいNGMプレートに移動させ、成体に成長させます。

ここから、すべての虫が死ぬまで、2〜3日ごとに成虫を観察します。各時点で、死んだ虫をプレートから取り除き、生存数と死亡数を記録します。私はワシントン大学病理学部のMatt Capline研究室のGeorge Setonです。

本日は、寿命の測定方法と、それを用いたC. elegansの観察について解説します。当研究室では、老化の遺伝学を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。

基本的な寿命実験には、添加物を一切含まない標準的なNGMプレートと、NGMにアンピシリンとフルオロデオキシウリジンを添加したAMP FUDRプレートの2種類のプレートが必要です。どちらのプレートにも大腸菌OP 50を播種し、その後、UV照射によって殺菌します。まず、10 mLのNGM溶液を調製することから始めてください。

60 mmペトリ皿1枚につき、固形のNGMを電子レンジの高出力設定で32秒ずつのパルス状に加熱し、完全に溶解させます。加圧による気泡の蓄積を防ぐため、パルスの間に培地を揺らしてください。液状になったNGMを55 °Cの水槽に入れるか、またはベンチ上に置いて冷却させます。培地が55 °Cまで冷却し、ガラス容器を素手で無理なく持てるようになった時点で、薬剤を添加する準備が整ったことになります。

薬剤添加プレートを調製する場合、100 mLのNGMに対し、150 mM FUDRを33 µL、および100 mg/mL Ampicillinを100 µL加え、混ぜ合わせるために旋回させます。Ampicillinは外来細菌の混入を防ぐためであり、FUDRは卵の孵化を防ぐために使用されます。これにより、成長した幼虫から分離するために数日ごとに線虫を移し替える必要がなくなります。

次に培地を注ぎ、プレートをベンチ上で2日間乾燥させます。プレートの乾燥が完了する前日に、LBアガー上の新鮮なストリークから単一のE. coli OP50コロニーを用いて液体LB培養を行います。60 mmプレート1枚あたり、少なくとも0.5 mLの培養液を準備してください。

OP 50培養液を37 °Cのシェーカーに入れ、一晩培養します。翌日、3,500 gの遠心力で10分間遠心分離し、OP 50細菌をペレット化します。上清を適切にデカンテーションし、細菌を10倍濃度で再懸濁します。

次に、各プレートに濃縮培養液を100 µLずつ接種します。NGMの表面に欠陥があると線虫が潜り込んでしまうため、ピペットチップがNGMの表面に触れないように注意してください。細菌がプレートの壁に近づかず、NGMの中央領域を覆うまでプレートを回し、その後、ベンチ上で24時間乾燥させます。乾燥後、細菌の増殖を停止させるのに十分な強度のUV線量をプレート表面に照射します。本手法では、strata gene UV straddle linker 2, 400を使用しています。

まず、プレートの蓋を外した状態でストラドルリンカーにセットします。次に、「Energy」を押してください。キーパッドで「9 9 9 9」を入力し、「Start」を押します。

プレートを約5分間、UVに曝露させます。UVで殺菌した細菌を含むプレートは、4 °Cで逆さまの状態で最大1か月間保存できます。このセクションでは、孵化日の揃った線虫集団の作成方法について説明します。

まず、約20匹の若成体虫を薬剤を含まない新しいNGMプレートに転写します。プレートを25 °Cで約1週間保持し、虫を増殖させ、1週間以内にすべての細菌餌を完食させます。成長停止したdower期のに孵化したばかりの虫が現れたら、20から30匹のdower幼虫を薬剤を含まない新しいNGMプレートに転写し、餌がある状態で25 °Cで培養します。

dower幼虫は2日以内に生殖能を持つ成虫となり、その後数日間、生殖能を維持します。ここで、生殖能を持つ成虫を10から15匹、薬剤を含まない新しいNGMプレートに転移させます。このプレートを、定時産卵（TEL）プレートと呼びます。

TELプレートを25°Cに保持し、線虫に産卵させます。これらの卵から孵化した個体を実験動物とし、6時間後に生存期間を測定します。TELプレートに卵があるか確認してください。

まだ卵が十分にない場合は、TELプレートを25°Cで合計24時間まで放置してください。その間、定期的に卵の有無を確認します。十分な数の卵が産み付けられたら、TELプレートから成虫を取り除きます。

一般的な寿命実験では、実験群あたり30～90個の卵が必要ですが、1枚のTELプレートで数百個の卵を生成することが可能です。生殖能力のある成体10～15匹が、6～8時間で約150個の卵を産みます。実験群を比較する場合、寿命に大きな差があるときは、わずか30匹の個体数でも統計的有意性を得ることができます。

よりわずかな差を区別するためには、より多くの個体数を使用する必要があります。次に、成虫のいないTELプレートを20 °Cで、孵化した卵およびワームがL4幼虫期に達するまで培養します。野生型C. elegansでは通常2日かかりますが、発育遅延表現型を持つ系統ではより時間を要する場合があります。

このセクションでは、齢同期させた個体群のライフサイクルを追跡する方法について説明します。まず、L4幼虫をTELプレートから準備済みのAMP FUDRプレートに移します。テストする各系統または条件について、通常は1プレートあたり25～30匹のワームを用いて、2～3枚のプレートを準備します。

AMP FUDRプレートを20 °Cで24時間インキュベートします。その後、線虫、培地、および細菌の状態を視覚的に評価し、線虫を新しいAMP FUDRプレートに転写します。線虫が細菌の餌の大部分を消費している場合、通常はこの作業を週に1回または2回行います。

実験の初期段階で、かなりの数の幼虫が見られる場合、これは通常、線虫がL4期ではなく若成虫の状態でAMP FUDRプレートに転移されたことを示しています。若成虫はFUDRが効き始める前に産卵することがあり、時折、幼虫がFUDRの影響を逃れて成虫に成長することがあります。このような状況では、これらの幼虫が実験結果を混乱させるため、成虫を新しいプレートに転移させ、幼虫が含まれる古いプレートは廃棄してください。

生存し増殖している細菌が観察された場合は、虫を新しいプレートに移してください。通常、AMPとUV殺菌の組み合わせにより、生きた細菌による実験への汚染は防止されますが、稀に発生することがあります。その際は、虫を移してください。

培地上に真菌の増殖が観察された場合、早期に発見できれば、ピペットチップやスパチュラを用いて真菌を除去することができます。直径が数ミリメートルを超えて増殖した場合は、通常、ワームを新しいプレートに移す方が効率的です。

2〜3日ごとに解剖顕微鏡を用いて、すべての個体の生存期間をスコア判定します。各個体が生存しているか死亡しているかを確認してください。

プレートを軽く叩きます。叩いた刺激に反応して動けば、その線虫は生存しています。プレートを叩いても反応しない場合は、頭部領域をズームアップし、白金線移送ピックで線虫の頭部を軽く叩いてください。

ワームを死亡と判定します。頭を動かして反応しない場合は、死亡したワームをプレートから取り除いてください。すべてのワームを確認した後、日付と生存数および死亡数を記録します。

固形培地で維持されている線虫は、潜り込んだり壁を登ったりして、時折プレート表面から脱出することがあります。脱出した線虫は、本研究から完全に除外します。終了後、プレートを20 °Cのインキュベーターに戻します。

さらに2〜3日待機し、プレートを再度確認します。すべての虫が死亡するまでこの手順を繰り返します。通常、各日に死亡した虫の数を反転させて各日の生存率を算出し、タイミングを合わせた産卵日を基準として生存曲線としてグラフにプロットします。

0日目。UV殺菌した培地を用いて20 °Cで維持された野生型C. elegans株の一般的な生存期間の中央値は、卵の状態から測定して約25日間です。

以上で、寿命の測定方法と、老化に伴う優雅さ（エレガンス）の観察方法について説明しました。この基本手順を修正することで、食事制限やRNA干渉など、さまざまな環境条件の試験に適用することが可能です。これらの詳細については、補足テキストで解説しています。それでは、以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。