焦点のCa ^{2 +過渡検出}

まず、カルシウム負荷溶液を調製し、加温してバブリングを行います。尿路を摘出し、切開して平らにピンで固定し、排尿筋のストリップを採取します。この排尿筋ストリップを負荷溶液に加え、インキュベートして洗浄した後、平らにピンで固定します。

組織内のカルシウム蛍光がレーザー光によって励起され、放出された光をキャプチャして結果を得ます。個々のフレームからなる動画は、連続するフレームを比較することで解析されます。また、バックグラウンドの減算が行われます。

細胞端のしきい値によって、イベントを検出する範囲が決定され、連続する脳の間で比率が算出されます。残りのイベントが定義済みの基準に一致する場合、それらはハイライトされ、ラベルが付けられます。こんにちは、オックスフォード大学薬理学部、Keith Brain教授とTom Kinane教授の研究室のJohn Youngです。

私はBrainおよびCanne研究室のRob Amosです。そして私はKeith Brainです。本日、JohnとRobが平滑筋におけるカルシウムイメージング技術を実演します。私たちは、自律神経からの神経伝達物質の放出と、それが平滑筋に及ぼす影響を研究するために、研究室でこの手法を用いています。

それでは始めていきましょう。カルシウムインジケーターのOrgan Green 488-BAPTA-1 AMは、50 µgの粉末を含む500 µLバイアルで提供されています。カルシウムインジケーターを調製するには、粉末に40 µLのOnic F1 27溶液を加え、30秒間静かに振ってください。その後、460 µLの生理食塩水（PSS）を加え、さらに30秒間静かに振ります。

最終溶液（10 µM Organ Green 488）により、125 µLの分注液を4本用意します。光への曝露を避け、目的組織を解剖するまで溶液を-20 °Cで保存してください。

カルシウム指示薬をフリーザーから取り出し、室温で解凍します。テストチューブに1 mLのPSSを入れ、33 °Cのウォーターバスに浸します。栓を用いてバブラーをテストチューブに固定します（またはパラフィルムを使用しても構いません）。その後、95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスを、秒速約1泡の速度でバブリングさせます。

動物から平滑筋組織を摘出します。本手順では、マウスの膀胱を使用します。摘出した臓器を約50 mLのPSSに入れ、洗浄します。組織の洗浄後、周囲の脂肪組織および結合組織を慎重に除去します。

尿路膀胱を平滑筋の層状構造に従って解剖し、開きます。膀胱頸部から、尾側端からドーム頂部に向かって縦方向に切開します。頭側端に沿って、主要な筋束の方向に切り出し、背側表面から長さ6〜8 mm、幅1〜2 mmのストリップを4本準備します。

摘出した組織と、あらかじめ加温しバブリングしたPSSを、10 µMのOrgan Green 488 Bを含むカルシウムインジケーター溶液125 µLと共に試験管に入れ、手で軽く振って混ぜ合わせます。試験管をウォーターバスに戻します。バブリングを再開し、ウォーターバスをアルミホイルで覆います。

十分な量の組織にカルシウムインジケーターが取り込まれるまでにかかる時間は、組織のサイズや平滑筋層の厚さによって異なります。例えば、マウスの排尿筋およびラットのoxsでは70分です。一方、ラットの排尿筋およびマウスのVAs deensでは、120分間インキュベートします。

組織にカルシウム指示薬をロードした後、顕微鏡観察の準備を行います。まず、組織をバブル処理したPSSで10分間洗浄します。次に、組織をSガードを敷いたプレパレーションディッシュに固定します。

わずかに伸ばして平坦なシート状にします。短い長さのピン（例えば、直径25～50 µmの銀線を2 mmに切ったもの）を用いて、組織を斜めに固定します。

対物レンズを傷つける可能性があるため、長さが数ミリメートルを超えるピンの使用は避けてください。組織の不随意な動きを最小限に抑え、イメージングに適した部位を容易に特定するためには、慎重に組織を固定することが重要です。組織を固定した後、プレパレーションディッシュを顕微鏡のステージ上に配置します。

PSSがディッシュのシリガードライニング領域から漏れ出さないように注意してください。漏れ出すと、広範囲にPSSが広がってしまう可能性があります。デモンストレーション目的でスーパーフュージョンを開始する際は、以下の手順を明所で実施します。

これらの実験は通常、暗所で実施されることに注意してください。ポンプをオンにして、標本を還流させます。PSSでは、100 milliliters per hourの流速がしばしば用いられます。

ヒーターユニットの電源を入れ、流入チューブ、流出チューブ、および温度プローブをプレパレーションディッシュに配置し、それぞれ底面のマグネットでメタルストリップに固定します。流出チューブの先端の高さによってPSSの深さが決まります。流出チューブからPSSが適切に除去されていない場合があるため、実際に除去されているか注意深く確認してください。

まず、ヒーターユニットの温度を33〜35 °Cの希望温度に設定します。低倍率対物レンズ（10倍または20倍）を用いて、組織を少なくとも10分間平衡化させます。

エピ蛍光顕微鏡または青色励起光を用いて平滑筋を観察し、モニターに適した領域を特定します。励起光への曝露によりインジケーターが光退色するため、一度に数秒以上の使用は避けてください。

画像検出アルゴリズムにおいて偽陽性が多く発生する可能性があるため、明るい構造物は避けてください。視野内に平滑筋細胞が多く、かつ動きが最小限である部位を選択するようにしてください。イメージングする部位を決定したら、40xなどの高倍率対物レンズに切り替えます。

平滑筋細胞が水平になるように、ステージまたは光軸を回転させます。これにより、細胞が高速スキャン軸と平行になります。これで、共焦点顕微鏡による平滑筋細胞のイメージング準備が完了しました。

本プロトコルでは、Leica SP2正立共焦点顕微鏡を使用します。ピンホールを1 airy discに設定します。custo opticチューナブルフィルターでのレーザー出力を25～35%の間に設定してください。

この値は、輝度と光退色のトレードオフとなります。データ解析の準備として、ImageJをダウンロードしてインストールしてください。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードし、最新のImageJ jarファイルをダウンロードして旧ファイルを置き換えることで、最新バージョンにアップデートします。次に、Excel writer jarファイルをダウンロードし、plugins jarディレクトリにインストールしてください。

これらのファイルをpluginsディレクトリにコピーします。pluginsマクロを使用して、これらのスクリプトをそれぞれインストールします。ImageJのインストール機能を使用してください。使用しているLeica SP2共焦点顕微鏡用のソフトウェアはLeicaと呼ばれています。

LCSは、各シリーズの個々のフレームを個別のファイルとして保存します。シリーズを再構成するには、再構成するすべてのフレームが単一のフォルダ内にあることを確認してください。

例えば、「data folder tiffs」を選択します。次に、[Plugins] > [Macros] メニューから「Leica SP two stacker」マクロを選択します。ルートディレクトリとして、この場合は「data folder」を選択してください。

ドロップダウンリストから目的のフォルダーを選択します。この例では、tiffsを選択して出力ディレクトリを指定するか、新しいディレクトリを作成します。例えば、data folder stacksなどが挙げられます。

次に、スクリプトが個々のフレームからシリーズを再構成し、動きによるズレを補正します。ここでは、シリーズ内のフレームをアライメントまたはマッチングさせる、無料で利用可能なプラグインであるStacks、Rig、およびTurboRegを使用します。それぞれのファイルをstacksフォルダにコピーしてください。

処理するスタックを読み込み、関心領域が明確に示されているフレームに移動します。他のフレームはこの参照フレームに合わせてアライメントされます。その後、プラグインの「Stacks」に移動します。

スタック登録。各部位において何が最も効果的であるかを決定するために、さまざまな変換をそれぞれ試してください。カルシウム・トランジェントの検出に影響を与える画像因子は、各部位の特定の特性や粒子パラメータを測定することによって変動します。

検出の感度と特異度が高まります。したがって、各部位について、比率の減算しきい値および細胞エッジしきい値を算出します。まず、[plugins]から[macros]、[install]を選択し、jn CTO dot oh eight release dot IJM JMを選択します。次に、[plugins]、[macros]、[load stack]へと進みます。

シリーズを選択し、以下の粒子パラメータを算出します。減算（subtracted）の閾値を算出するには、背景測定と思われる箇所に矩形の関心領域（ROI）を選択してください。その平均値を記録します。比率（ratio）の閾値を算出するには、平滑筋細胞または細胞群の光学的に平坦な領域の周囲に矩形の関心領域（ROI）を選択してください。

平均値と標準偏差を測定し、記録してください。この工程をさらに2回繰り返すか、Shiftキーを押しながら3つのボックスを同時に描画することも可能です。比率の閾値を計算し、記録してください。

標準偏差を平均値に1を加えたもので除し、その結果に32を乗じて算出します。3回の繰り返し実験から得られた値を平均化します。32という係数は、前のフレームからの変化がない場合に整数値32にマッピングされる比率演算アルゴリズムを考慮するために必要です。これにより、比率の増減を検出するための十分なダイナミックレンジが得られます。

8ビット画像の場合、[画像調整]の[しきい値]を選択します。[白黒]を選択し、上部スライダーの制限値を定義して、対応する値を記録してください。

これはスライダーの右側にあります。黒い領域で発生したイベントのみがカウントされます。リセットをクリックしてください。

比率の減算しきい値（subtracted threshold for ratio）および細胞エッジのしきい値（cell edge threshold）が算出されたので、画像スタックの解析を行います。解析するスタックの場所を決定してください。この段階では、シリーズを1つだけ選択します。

それが最初のファイルであり、最後のファイルも同様である必要があります。次に、データファイルおよびスタックの出力先を選択します。例えば、「data folder output」などが挙げられます。

減算しきい値、比率しきい値、およびセルエッジしきい値の値を入力します。その他の設定はデフォルト値のままにします。アルゴリズムにより2ペインのウィンドウが表示され、左側に処理済みのシリーズが、右側にオリジナルが表示されます。

出力フォルダからこのファイルを開き、偽陽性の数および目視で確認できるイベントが検出されなかった事例を評価するために、慎重に内容を確認してください。各シリーズについて、アルゴリズムは検出されたイベントの振幅、面積、位置などの特性を詳細に記したExcelファイルを作成します。アルゴリズムが出力した画像ファイルをレビューして特定した偽陽性は、このExcelファイルから手動で削除することが可能です。ただし、削除を行う際は厳格な基準を設けてください。

これは平滑筋におけるカルシウム一過性変化の動画です。この例では、5 Hzで取得した100個の個別のフレームで動画が構成されています。例えば、特定の薬剤がカルシウム一過性変化の頻度に及ぼす影響を調査する場合、1回の実験につきこのような動画を多数取得します。

ここでは、平滑筋細胞における多数の自発的なカルシウム・トランジェントが観察されます。ここでは、粒子検出アルゴリズムの結果が示されています。各シリーズについて、アルゴリズムは、振幅、面積、位置などの検出されたイベントの特徴を詳細に記したExcelファイルを生成します。

これまで、尿路などの平滑筋器官におけるカルシウム・トランジェントのイメージング手法と、当研究室で開発したアルゴリズムを用いてこれらのカルシウム・トランジェントを分析する方法を実演しました。重要な点は、カルシウムイメージングに向けて組織を十分に準備することです。本日の実演で用いた組織の場合、結紮組織を取り除き、視野を妨げる可能性のある脂肪をすべて除去することが重要です。

また、組織を平らにピン留めすることも重要です。それでは、実験の成功をお祈りします。ご視聴ありがとうございました。