全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

この手順は、周囲のマトリックスに埋め込まれたアライメントランドマークを用いて埋没処理を行うため、Neuroscience associatesに送付された、4% PFAで灌流・摘出・凍結保護処理済みの脳を受領した時点から開始されます。脳は冠状面で切断し、専用のバスケットと容器を使用して、所望の厚さで連続切片を作成することで、脳の前後方向の全範囲を網羅させることができます。バッチ免疫処理を行うことで、脳全体におけるタンパク質の空間的な発現パターンを決定することが可能です。

こんにちは。モントリオール大学視覚神経科学研究所、検眼学校のShaheen Zur博士です。こんにちは。同じくモントリオール大学視覚神経科学研究所、検眼学校のMark Burke博士です。こんにちは。モントリオール大学検眼学校の視覚神経科学研究所の所長、Mo Petto博士です。

本日は、サル脳全体における大規模なタンパク質検出のためのバッチ免疫染色の手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて脳全体における標的タンパク質の発現パターンを調査し、同一個体内のタンパク質発現を比較・対照させています。それでは、始めていきましょう。

組織学的処理の前に、全身灌流による固定、後固定、および段階的なショ糖溶液による凍結保護処置を施した霊長類の脳を用意します。この段階で、脳をNeuroscience Associates社に送付し、同社の独自技術を用いて包埋および凍結切片作成を行います。返却後、包埋マトリックス内に7つのアライメントランドマークが配置されており、これにより組織学的処理の完了後に切片を適切に方向付けし、再整列させることができることが確認できます。

切片作成と並行して、後に解剖学的マップの3D再構築に使用できるデジタル画像を撮影します。神経科学者の共同研究者が組織を処理し、脳全体にわたる厚さ50 µmの遊離冠状断連続切片を作成します。これが完了すると、切片の組織学的処理を開始できます。

組織学的処理を開始する際、通常、抗体1種類または染色1回につき約140枚の切片を処理します。ここでは、非リン酸化ニューロフィラメントタンパク質に対するモノクローナル抗体であるSMI 32で処理した少数の切片を用いて、この手法を実演します。手順全体を通じて、専用の染色皿とバスケットを使用することで、大量の遊離切片を同時かつ効率的に処理することが可能になります。

これにより、すべての切片で染色の結果が均一になります。最初のステップとして、Triton X-100と正常馬血清を含むPBSベースの溶液中で、切片を60分間インキュベートします。これにより、背景染色の原因となる抗体分子の非特異的結合を抑制します。

次に、切片を一晩インキュベートします。翌日、Triton X 100および正常馬血清を添加したPBSベースのSMI 32抗体溶液中で、切片を洗浄液で10分間×3回洗浄し、その後、Triton X 100および正常馬血清を含むPBSベースのビオチン化マウス二次抗体溶液を用いて、室温で2時間インキュベートします。

さらに10分間の洗浄を3回行った後、切片を avadon biotin 標識 horse radish peroxidase コンプレックス溶液に浸し、室温で1時間静置します。最後に、再度一連の洗浄を行った後、切片を D amino benzine 反応液に10分間浸すと、免疫反応性ニューロン内に茶色の染まりが生じます。その後、染色バスケットを取り出し、切片を PBS に浸すことで反応を停止させます。

PBSで5分間の洗浄を2〜3回行った後、大きなペトリ皿と非常に柔らかい絵筆を用いて、切片をガラススライドに個別に封入する準備が整います。切片をPBS緩衝液の容器から取り上げ、ゼラチンコートされたガラススライドに個別に貼り付けます。その後、サンプルをドラフトチャンバー内で一晩自然乾燥させ、翌日に工程を進めます。

切片を脱イオン水に浸して洗浄し、封入工程で残った塩結晶を取り除きます。その後、段階的なエタノール系列で脱水し、キシレンで洗浄した後、Permount封入剤を用いてカバーガラスを被せます。この段階で、封入剤を硬化させるため、スライドを水平な状態で約1週間から10日間保存してください。

その後、スライドはスライドボックスに保存するか、顕微鏡によるイメージングに供することができます。この手法により、サル脳全体における標的タンパク質の完全な発現プロファイルを得ることが可能です。ここでは、FMRP、neuN、およびSMI 32の発現を捉えた代表的な冠状断切片を示します。

同一のサル脳を用いて、脳全体にわたる標的タンパク質のバッチ免疫染色を完了する方法を説明しました。この手順では、各種溶液でのインキュベーション中、すべての切片を穏やかに攪拌し、常に完全に浸漬した状態に保つことが重要です。

さらに、解剖組織のカバーガラス封入を行う際は時間をかけて丁寧に行い、組織の完全性を損なわないように注意しながら、しわや折りをできる限り取り除いてください。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。