に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

この手順は、新鮮なブドウジュースプレートを用いて、30〜60分間胚を回収することから始まります。レイクケージからプレートを取り出した後、湿らせたブラシで胚をすくい上げ、両面粘着テープの上に配置します。ピンセットの片側を使用して、1つの胚をテープ上で軽く転がし、卵膜を破ります。

胚を拾い上げ、カバーの上にそっと置きます。その上にhet glueの層を被せます。十分な数の胚が集まるまで、この操作を繰り返します。

脱水後、胚は注入可能な状態になります。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校分子細胞生物学部のJonathan Sculley博士の研究室のIngrid Bruce Musherです。本日は、ショウジョウバエのシンシチウム胚にマイクロインジェクションを行う手順をご紹介します。

本手順では、有糸分裂における微小管およびミトシンベースのモーターの役割を研究します。例えば、特定の有糸分裂タンパク質の抗体やその他の阻害剤をマイクロインジェクションします。阻害剤が有糸分裂に及ぼす影響を分析することで、標的タンパク質の機能を特定することが可能です。

それでは始めていきましょう。実験の2〜3日前に準備を開始し、プラスチックボトルの反対側に約1 cm²の小さな穴を2つ開けて、産卵ケージを作成します。穴に脱脂綿を詰め、空気が流れるようにします。

ショウジョウバエをボトルの中に軽く叩き入れてから、ブドウジュースプレートで蓋をします。酵母を用いる場合は、レッグケージを室温で保持します。ハエは最大10日間産卵するため、実験の少なくとも1日前までに準備してください。注射用の針を準備し、4 °Cで保存します。

実験当日、ニードルの準備と充填を行います。まず、ラベル付けしたtubulinをフリーザーから取り出し、氷上で5〜15分間静置します。次に、GPEMバッファーで希釈し、4°C、13,000 RPMで10〜15分間遠心分離します。

最後に、1〜2 µLを針にロードし、4 °Cで保存します。これは、針の中での温度誘起重合を防ぐためです。カバーガラスをセットする前に、両面テープを巻き付けて100 mLボトルに入れ、ヘプタン接着剤を作成します。

ヘプタンを約 50 milliliters 加え、ボトルを密閉し、数日間揺らします。胚を準備する前に、注入前に胚を配置するための脱水チャンバーを作成します。作成方法は、100 millimeter のペトリ皿の中に 35 millimeter のディッシュを配置して台にし、その周囲に乾燥剤として無水硫酸カルシウムを加えます。この際、乾燥剤の高さが台の高さを超えないようにし、蓋をします。

胚の準備を開始するには、まず、酵母を含むブドウジュースプレートを1時間ごとに交換して湖のケージから胚を回収します。回収開始から約2時間後に胚のイメージングを行う必要があります。カバーガラスを準備するために、カバーガラスを顕微鏡スライドの一方に置き、動かないように四隅をテープで固定します。綿棒を使用して、ヘプタン接着剤をカバーガラス上に1層、直線状に塗布します。

接着剤は粘性が低く、数秒で乾燥するものである必要があります。粘度が上がりすぎた場合は、ヘプタンを追加してください。最後に、カバーガラスの隣のスライドガラス上に、両面テープを貼付します。

湿らせたブラシで滑らせます。グレープジュースプレートから胚を慎重に回収し、スライド上の両面粘着テープの上に置きます。次に、ピンセットの片側を使用して、卵膜が破れるまで胚を両面粘着テープ上で転がします。

胚をコリアンの上でそっと転がしてピンセットに付着させ、カバーガラス上のヘプタン糊の上に配置します。胚の長辺がカバーガラスの長辺と平行になるようにスライドさせます。1列に10から20個の胚を配置してください。

カバーガラスを取り外し、脱水チャンバーに3〜8分間置きます。時間は地域の湿度および注入量によって異なります。次に、カバーガラスを真空グリースを塗布したメタルチャンバーの上に配置します。

最後に、さらなる脱水を防ぐため、胚をハロカーボンオイルで覆います。これで胚に注入を行う準備が整いました。まず、16倍の対物レンズで胚を探します。

胚を移動させ、焦点面を変えずに針を確認します。針を中央に配置し、X方向またはY方向に動かさないようにして、針を上に移動させます。針を開くには、カバーガラスの端を視野に入れますが、針が位置する場所には重ねないようにしてください。

そして、針を同じ焦点平面まで下げます。カバーガラスに当たってゆっくりと割れるまで、慎重にカバーガラスを移動させます。その後、針を上に移動させます。

次に、胚を視野に入れます。針をオイルの中に下ろし、針先から液滴が適切に得られることを確認してください。胚をゆっくりと針の方へ移動させ、胚の中に液滴を注入した後、胚を離します。

すべての胚に注入が完了したら、60倍または100倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で観察します。コントロール胚は、この動画のような外観になります。これは、GFP tubulinとRFP histoneを発現している胚を、回転円盤型共焦点顕微鏡の100倍対物レンズで撮影したものです。

表示されている合計時間は8分です。極間距離のプロットは再現性が非常に高く、コントロール胚における成功の信頼できる指標となります。これらは、サイクル11から13にかけてここで示されているような結果になるはずです。

この動画では、別の対照胚を示しています。この胚はKLP 61 FGFPを発現しており、r Domine tubulinが注入されています。こちらも回転円盤共焦点顕微鏡の100 x 対物レンズを用いて撮影され、総時間は7分間です。

この動画はマイクロインジェクションの直後に撮影されたもので、動画の開始時に r Domine tubulin の濃度勾配が明確に観察されます。これらの胚は、Klp 61 F 抗体のマイクロインジェクション後における Klp 61 F の阻害を研究するために使用できます。紡錘体から Klp 61 FGFP が消失していることがわかります。

ここまで、ショウジョウバエの切開胚へのマイクロインジェクション方法について説明しました。この手順を行う際は、コントロール実験を実施すること、まずバッファーまたはルチンのみを注入する練習を行い、細胞化を通じて有糸分裂が正常に進行することを確認することが重要です。すべての注入が安定し、損傷を与えないことが確認できたら、阻害剤を注入して、その特定の阻害による影響を研究することができます。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。