移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

こんにちは。Cecilia Owens研究室のHillary Kempです。そして、私はCecilia Owensです。Hillaryと私は、シアトルにあるFred Hutchinson Cancer Research Centerの基礎科学部門に所属しています。

本日は、遺伝的モザイクとも呼ばれる、キメラゼブラフィッシュ胚を作成する手法をご紹介します。この手順により、発生過程における遺伝子機能の細胞レベルでの基盤を評価することが可能になります。これにより、特定の遺伝子が、変異表現型を示す細胞内で機能しているか（細胞自律的機能）、あるいはそれらの細胞を取り巻く環境内で機能しているか（細胞非自律的機能）を検証することができます。

これらのモザイク胚は、胚盤胞期または初期原腸陥入期の野生型胚と変異型胚の間で細胞を移植することで作製します。その後、ホスト環境におけるドナー由来細胞の表現型と遺伝子型を観察し、遺伝子機能を評価します。それでは始めましょう。

プロトコルのこのセクションでは、移植後にドナー由来細胞の運命を追跡できるよう、ドナー胚にリネージ染料を注入します。この手法を用いて、あらゆる種類の核酸を注入することも可能ですが、胚を扱う前にDNAを注入する場合は、標識ステップを省略してください。ペトリ皿の最も広い部分にガラススライドを45度の角度で挿入し、注入用ディッシュを準備します。ディッシュの4分の3まで、1.2% aos 含有 pen strep 胚培液を満たしてください。

アガロが固まった後、スライドを取り除いて面取りされた溝を作ります。溝にpen strep embryo mediumを充填します。次に、1細胞期の胚の酵素的処理に進みます。

1細胞期の胚を、0.5 mg/mL Pronase溶液中で1〜5分間インキュベートします。脱殻の様子を注意深く観察してください。

絨毛膜が目に見えて崩壊し始めたらすぐに、胚をシステムウォーターに浸します。これにより、すべての絨毛膜が流れ出し、胚はビーカーの底に留まります。胚が再び水面に触れないようにすることが非常に重要です。ほとんどの胚から絨毛膜が除去されていますが、一部は外側に漂っています。

卵膜（コリオン）に包まれたままの個体がある場合、このようにピペッティングすることで、胚を水面に接触させることなく卵膜から脱出させ、放出することができます。コーティングされた胚を扱う際は、端を滑らかにするために火炎研磨したピペットを使用することが重要です。広口の火炎研磨ガラスピペットを用いて、壊れやすいDECコーティング胚をインジェクションディッシュの溝へ慎重に移します。

次に、1つのファイルをこの溝にロードします。これで、精密に校正されたファイアポリッシュ済みガラス注入ピペットと圧力注入装置を用いて、胚にリネージマーカーを注入する準備が整いました。針の先端を砕くために胚培養液を満たしたディッシュを、また針を校正するためにオイルを満たしたディッシュを使用します。

これは一般的な標準研究室グレードのミネラルオイルです。研磨済みの時計修理用ピンセットを用意し、接眼レンズを覗いて適切なサイズを確認しながら、針の両側にピンセットを当て、チップをそっと折り取ります。これは、直接見なければ実際に行うことができません。開始前に、導入する染料またはリボヌクレオチドの容量を決定します。

ミネラルオイルを入れたディッシュ内で、ボーラスのサイズを測定します。マイクロインジェクターを1回または2回パルスさせたときに1ナノリットルのボーラスが注入されるよう、針を切断して調整してください。ボーラスの体積は、接眼マイクロメーターで測定した直径から算出できます。

1～3%の蛍光デキストラン溶液を1ナノリットル、1細胞期から4細胞期の間の被覆胚の卵黄に直接注入します。胚を針の直下に配置します。針を卵黄の中心にゆっくりと刺し、フットペダルを押します。

注入する際は、色素が細胞内に輸送されるように、卵黄流に注入することが重要です。この注入量で、キメラ胚内の細胞を数日間の発生過程を通じて追跡するのに十分な量となります。理想的には、細胞が4細胞期に達する前にこれを行います。注入した胚は、新鮮なpen strep添加胚培養液を満たしたコーティング済みのペトリ皿に入れ、低密度で培養してください。

注入後の胚は発生速度がわずかに低下する傾向があるため、胚を25、28、および31 °Cの異なる温度でインキュベートして発生段階をずらし、移植が可能な時間枠を最大限に確保してください。ゼブラフィッシュ胚盤胞への細胞移植に使用する装置は、ドライブ制御式Hamiltonシリンジと、三方活栓で接続されたミネラルオイルのリザーバーおよびマイクロピペットホルダー、およびそれらを結ぶ柔軟なチューブで構成されています。気泡が混入すると吸引と圧力の制御ができなくなるため、システム内からすべての気泡を取り除いてください。

少なくともDX倍率以上の高品質な光学系を備えた実体顕微鏡を使用します。マイクロピペットホルダーとニードルの位置を制御するために、NARA shige社の手動マイクロマニピュレーターの使用を推奨します。移植部位に振動が伝わるのを防ぐため、必ずマグネットベースを用いてベンチに固定してください。

移植用針は、電極ポーラーで緩やかにテーパー状に引き延ばしたガラスキャピラリーピペットで作製します。解剖顕微鏡下でのピペットの引き出し方の詳細については、Miriam Goodmanの研究室によるJoVEプロトコルを参照し、引き出した針の先端を切り離してください。胞胚期の移植では、針の外径を約50～60 µmに、原腸胚期の移殖では30～40 µmに設定する必要があります。

浸透性を高めるための胃ステージ転送に向けて、まずマイクロフォージを用いて針の先端に鋭いバーブ（返し）を作成する必要があります。まず、針の先端をマイクロフォージのフィラメントに近づけて先端を滑らかにします。次に、ベベルの leading edge（前縁）がフィラメントに接触するように針を回転させます。針の前縁がフィラメントに接触したら、素早く引き離してバーブを作成します。

細胞へのダメージを避けるため、バーブは直線的であり、針先が曲がっていないことを確認してください。装置と移植用針の準備が整えば、キメラ胚を作成できます。詳細な運命地図の情報が不要な場合に、胚間で細胞を移植するには、胞胚期の移植が行われます。始原生殖細胞を除き、この段階ではほとんどの細胞が一般的に特定の運命に決定していません。

胞胚の運命地図により、外胚葉になる細胞と中胚葉になる細胞を区別することが可能です。中胚葉および内胚葉の前駆細胞は胞胚期胚の辺縁付近に位置していますが、神経系および表面外胚葉になる外胚葉前駆細胞は胚の辺縁から離れた位置にあります。したがって、胞胚期の胚に細胞を移植する場合、それらの細胞を推定中胚葉または推定外胚葉に標的化させることができます。

しかし、外胚葉または中胚葉のどの領域に細胞を標的にすべきかは不明であるため、特定の領域を標的にすることはできません。胚の背側がどこにあるかを確認し、胚芽期において、胚培地で溶解させた1.2%アガロースを半分まで満たしたペトリ皿に、くさび形の突起が対になって並んだプラスチック製モールドを浮かべて、あらかじめ注入用ディッシュを準備します。アガロースが凝固した後、テンプレートを取り除くと、胚1個を保持するのにちょうど十分な大きさの三角形のウェルが列状に残ります。

移植用モールドにpen strep添加胚培養液を満たし、火炎研磨したガラスピペットを用いて、胞胚期の胚を各ウェルに1つずつロードします。次に、胚を移植用ウェルに移し、最初は横向きに静置させます。ドナー胚を1列に、ホスト胚をその隣の列に配置するように胚を並べます。

胚に移植針を刺入する際、針によって胚がウェルの後壁に押し付けられるように、ステージ上のディッシュを配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、移植針をかなり急な角度でディッシュ内に降ろします。理想的には、移植針が約45度の角度で胚に刺入されるようにしてください。

針先が胚培地の表面下に入ったら、ハミルトンシリンジを制御しているマイクロメータードライブを回し、少量の胚培地を針の中に吸い込みます。最も精密な制御を行うには、ミネラルオイルと胚培地の界面が針の細いテーパー部分にあり、先端に近すぎない状態を維持する必要があります。針を用いてドナー胚を慎重に位置決めし、その後、針を一度引き戻してから、胚の芽胞期（ブラストゥラ）キャップの目的の位置に挿入します。

素早く強く刺入することで、胚を転がらせることなく貫通させます。細胞のせん断を防ぐため、ドナー細胞をゆっくりと慎重に針に吸い上げます。目的の細胞数を吸い上げた後は、卵黄を針に入れないように注意してください。

圧力をわずかに反転させて吸引を停止し、針を抜いてホスト胚を所定の位置に移動させます。移植皿を動かすことで、移植針を用いてホスト胚の位置を微調整できます。ただし、卵黄に触れないよう注意しながら緩やかに回転させてください。ドナー細胞をホスト胚に注入する際は、卵黄を胚内に取り込まないようにしてください。卵黄が混入するとドナー細胞が損傷し、死滅してしまいます。細胞転移が完了した後、1つのドナー胚から複数のホストへ移植することが可能です。

ドナーとホストのペアを、コーティング済みの24ウェルプレートに移し、さらに発生させます。胞胚期において細胞が特定の運命に決定づけられていないという原則に対する唯一の例外が、原始生殖細胞です。原始生殖細胞は発生の非常に早い段階で指定され、原始生殖細胞としての運命に決定づけられています。

非常に早い段階から、始原生殖細胞は胚盤胞および原腸陥入期の胚の縁付近に位置しています。したがって、移植実験の目的が始原生殖細胞の移植である場合、ドナー胚のどこから細胞を採取するかが非常に重要であり、ホスト胚のどこに移植されるかは重要ではありません。一方、体細胞に関するルールは、ホスト胚のどこに移植されるかがその運命を決定するという点です。

始原生殖細胞の場合、それらの運命はすでに決定しているため、ドナー胚のどこから採取するかが重要になります。始原生殖細胞を移植することが目的であれば、ドナー胚の極付近から細胞を回収する必要があります。これらの細胞は、このシート期あるいはハイ期という発生段階において、胚の極付近に3〜4個の細胞からなる4つの小さなクラスターとして位置しています。採取の際は、誤って卵黄まで吸い込まないよう、非常に慎重に行わなければなりません。

以上が手順となります。次に、宿主胚へ移します。始原生殖細胞は、導入された胚の生殖堤領域へと自律的に遊走します。したがって、これらの始原生殖細胞を辺縁部に移植する必要はなく、自然に到達します。

したがって、単に胚後の任意の場所に移植して戻すだけとなります。他のあらゆる種類の移植とは全く異なり、生殖細胞移植において重要なのは、ドナー細胞がどこに由来するかということです。原腸陥入期のホストに細胞を移植することで、胚楯が可視化した際に現れるゼブラフィッシュの運命地図を利用することが可能になります。

異なる組織型だけでなく、将来の中枢神経系におけるドメインの区別が可能になります。原腸胚期の胚間で細胞を移植する場合、プロトコルに多少の変動はありますが、一般的な手順は胞胚から原腸胚を扱う操作と同様です。まず、ガラス製ディープウェルスライドの凹部にメチルセルロースを垂直に塗り、次に火炎滅菌した転送用ピペットを用いて、pen strep添加胚培養液を十分な量注入します。

1個のドナーと、原腸陥入期の3個のホストをディプレッションスライド上に配置します。ホストよりもわずかに若いドナー胚を選択してください。原腸陥入を操作するために新しいツールが必要であり、それは2ポンドテストの釣り糸を短く切り、その端をキャピラリーチューブの末端に挿入したものです。

このようにして小さなループを作ります。このループを用いて、ドナー胚とホスト胚をゆっくりとメチルセルロースストリップの上に転がし、固定されるまでメチルセルロースの中に押し込みます。標的領域が上に来るように位置を調整して転がします。

移植の際、卵黄を傷つけることなくドナー細胞を届けるために、針を胚に接線方向から刺入します。胃期（Gastro stage）の移植は、ステージ固定機能付きの複合顕微鏡を用いて行うのが最適です。マイクロマニピュレーターの操作部を使用して、移植針の先端に焦点を合わせます。

マイクロピペットホルダーと針をかなり浅い角度に配置し、スライド上の凹みの端で許容される限り、針が水平に近くなるようにします。次に、ドナー胚を刺します。適切に固定されていれば、胚が古すぎて針が容易に貫通できない場合を除き、移植針が刺入される際に胚が転がることはありません。

卵黄を貫通させないよう、針はEDLよりもわずかに深い焦点面に胚を刺入してください。一度刺入すれば、ドナーから大量の細胞を回収でき、最大3回のホスト細胞注入に使用可能です。細胞を吸引する際、必要に応じて針を動かしながら吸引することで、卵黄の混入を避けてください。

細胞数をさらに確保したい場合は、同じ針を用いて追加の胚から細胞を回収できます。ホスト胚への細胞注入時は、細胞を一箇所にまとめて注入するのではなく、標的領域に針を引き抜きながら細胞を放出してください。これにより、ドナー細胞が目的の組織に寄与する可能性が高まります。細胞移植が完了したら、スライド全体をペトリ皿に入れ、pen strep embryo Mediumを慎重に満たしてください。

その後数時間かけてメチルセルロースが溶解し、胚が放出されます。移植する細胞数は、実験の具体的な目的に応じて決定します。単一のドナーからの細胞を、移植翌日の朝に3〜4匹のホストに移植することが可能です。

ドナー細胞のターゲティングが成功したかどうかを確認するために、ホストを検査することができます。胞胚期の始原生殖細胞の移植に成功すると、蛍光標識された細胞が、ylkとその伸展部の接点付近の腹側に位置します。以上で、原腸胚期および胞胚期の移植方法について説明しました。

この手法を行う際は、細胞によって標的とする組織に適した移植方法を選択することが重要です。例えば、細胞が中胚葉へ移行するか外胚葉へ移行するかを判定するには、胞胚期の移植で十分です。また、この手法を用いて原始生殖細胞を標的にすることも可能です。

より詳細なマッピングを行う場合は、すでに背側が決定している原腸期の移植を行うのが望ましいです。この手法を用いることで、神経系のさまざまな部位、特に前脳、中脳、後脳、および脊髄に細胞を標的にして導入することができます。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。