レンチウイルスの生産

この手順は、293T細胞にレンチウイルス、プラスミド、およびウイルスパッケージングベクターをトランスフェクションすることから始まり、少なくとも48時間の培養期間後にウイルス上清を回収します。上清はろ過し、超遠心機を用いて濃縮します。ウイルスペレットをPBSで再懸濁してウイルスタイターを求め、まず濃縮ウイルスを完全培地で希釈し、次に段階希釈を行い、レンチウイルスを用いて細胞に感染させます。

こんにちは。私はカリフォルニア大学サンフランシスコ校糖尿病センターのMichael McManus研究室のShein Wongです。Michael McManusです。本日は、レンチウイルスの作製手順について解説します。

本手順では、RNA干渉のためのレンチウイルスを研究室で作製します。それでは、開始しましょう。まず、293T細胞にトランスフェクションするためのDNAを準備します。

まず、1.5 mLチューブ内で、30 µLのFuji sixと600 µLの無血清培地を混合し、FU gene sixトランスフェクション試薬を希釈します。Fuji sixを培地に加える際、チューブの壁面に触れないように注意し、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブのキャップ内で、4 µgのレンチウイルスプラスミドを1.33 µgと混合します。

各第3世代ウイルスパッケージングベクター。レンチウイルスプラスミドがDNAを含有しています。ウイルスは感染したすべての細胞のゲノムに挿入され、一方でパッケージングベクターはレンチウイルス作製に必要なその他のすべてのタンパク質の遺伝子を含んでいます。蓋を閉め、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。

DNAとトランスフェクション試薬を室温で15～20分間インキュベートします。次に、準備したDNAをHEK 293細胞にトランスフェクションします。24時間前に播種し、コンフルエンシーが50～70%に達した細胞を、組織培養フード内で使用してください。準備したDNAをすべて293細胞のプレートにピペッティングし、プレートを前後にゆっくりと傾けて優しく混ぜ合わせます。細胞をインキュベーターに戻し、回収まで48～96時間、ウイルス産生を継続させます。インキュベーションの間、293細胞は、目的のDNAのRNAコピーをゲノムに含むレンチウイルスを産生します。

次に、ウイルスを回収します。インキュベーターから細胞を取り出します。組織培養フード内に、0.4または5 µmのシリンジフィルター、使い捨ての10 mLシリンジ、およびBeckman社のUltraClear遠心チューブを用意しておきます。

使い捨てシリンジを使用して、ウイルスを含む上清を除去します。先端に0.45 micronのシリンジフィルターを取り付け、ウイルスをUltraClear Beckman遠心チューブにろ過します。このフィルターにより、細胞を除去してウイルスのみを通過させることができます。ろ過後、ウイルス産生細胞はすべて廃棄してください。

培養プレート、シリンジ、およびフィルターを10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に45分間浸します。ウイルスの回収およびろ過が完了したので、まず超遠心分離によってウイルスを濃縮します。無血清DMEMを用いて、ウイルス含有チューブすべての重量を0.2g以内の誤差に調整し、バランスを合わせます。

次に、バランスを調整した遠心管をSW 41 TIまたはSW 28ローターバケットに入れます。ローターバケットを密閉し、ローターに固定します。その後、ローターを超遠心機の中に設置します。

SW 41 TIローターを用いて25,000 RPM、またはSW 28ローターを用いて24,000 RPMで、4°Cにて約90分間ウイルスを遠心分離します。遠心分離後、組織培養フードに戻し、チューブを反転させてSNATを10%漂白剤の入った容器に注ぎ入れます。キムワイプを使用してペレット周囲の余分な液体を吸収し、ペレットを再懸濁する準備が整うまで、チューブを便利なラックに反転させた状態で5分以内に保持します。

ウイルスのペレットを再懸濁させるため、フィルターチップを用いて、滅菌済みでろ過済みのPBS 100 microlitersをチューブに加えます。その後、ピペッティングを20回ほど繰り返します。完全に再懸濁させるため、ウイルスを4 degreesで一晩静置します。

ウイルス調製液は、4°Cで約1週間、-80°Cで最大1年間保存可能です。空になったチューブはすべて、廃棄前に10%漂白剤で処理してください。1週間を超えてウイルス調製液を使用する場合は、冷蔵庫で保存してください。

今後の実験用に5〜20 µLの小分け分注液を数本と、タイトレーション用に3〜5 µLの分注液を1本作成し、これらの分注液を約-80°Cで保存します。次のステップはウイルスタイターの決定です。レンチウイルスプラスミドに蛍光レポーター遺伝子を組み込んでいる場合は、感染細胞が蛍光を発するため、フローサイトメトリーを用いてウイルスタイターを決定できます。

まず、96ウェルプレートの1行にあるウェル1から6に、濃縮ウイルス3 µLを完全培地1.5 mLで希釈します。100 µLの完全DMを用いて、これら6つのすべてのウェルで以下の連続希釈を行います。最初のウェルには、ウイルスを含まない培地100 µLを加えます。

これは未染色のコントロールです。2番目のウェルに希釈したウイルスを100 µL加え、3番目のウェルにも同様に加えます。次に、2番目のウェルの混合液を100 µL、4番目のウェルに加えます。

3番目のウェルから5番目のウェルへ100 µLを加えます。4番目のウェルから6番目のウェルへ100 µLを加えます。5番目のウェルから100 µLを加えます。

最後に、6番目のウェルから100 µLを取り出して廃棄し、漂白剤で処理します。その後、すべてのウェルの全量をDMEMで200 µLに調整します。希釈を繰り返すごとに、ウイルスの濃度は半分になります。なお、これらは推奨される希釈倍率であり、ほとんどの高濃度ウイルスのタイタリングにおいて良好に機能します。

ウイルスのタイターが低い場合や濃縮されていない場合は、希釈倍率を調整する必要があるかもしれません。未使用の希釈ウイルスは、バイオハザード廃棄物容器に捨てる前に、10%次亜塩素酸ナトリウム液で45分間処理してください。6つのウェルのそれぞれに、健康で活発に分裂している293T細胞を約15,000個ずつ加えてください。

単一の96ウェルプレートを使用して、16種類のウイルス調製液のタイターを測定できます。各ウェルの液量を200 microlitersまで補充し、細胞をインキュベーターに戻して、少なくとも48時間感染を進行させます。インキュベーション後、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光を解析します。ウェルあたりの蛍光細胞の割合から、タイターまたは添加したウイルス1 milliliterあたりの感染性ウイルス粒子数を決定できます。

フローサイトメーターの結果を解析する際は、以下の式を用いて1 mLあたりの感染単位数を算出します。なお、正確なタイター算出が可能なのは、感染細胞1個あたりにウイルスが1回以下しか組み込まれていない場合に限られます。

これを確実にするため、計算には感染率が15%未満の細胞を使用してください。感染率が高い細胞は、1細胞あたりに複数のウイルスが組み込まれている可能性が高いためです。ステップ2で推奨される希釈を行えば、この感染率の範囲内に収まるサンプルがいくつか得られるはずです。

理想的には、いくつかのサンプルを用いてタイトレーションプロットを作成し、そこから最終的なタイターを算出してください。フィッティングさせた直線から得られる計算式を用いてウイルスタイターを算出できますが、必要に応じて単一のサンプルからタイターを算出することも可能です。非濃縮ウイルスのタイターは1×10⁷ transducing units/mL、濃縮ウイルスのタイターは1×10⁸ transducing units/mLになると予想されます。

本手順におけるレンチウイルスの作製方法について説明しました。すべてのバイオセーフティ規制を遵守し、廃棄物を適切に処理することが重要です。以上で終了となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。