組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

細胞を封入する段階的なプロセスは、ハイドロゲル型およびその他の材料の準備と滅菌から始まり、続いて細胞を個別の集団に分離し、各ゲルのセットに合わせてチューブに分注します。その後、細胞の存在下でゲル化を行い、続いてin vitroまたはin vivoでの培養期間を設けます。細胞挙動に関するダウンストリーム解析には、生存率、形態、増殖、および分化の試験が含まれます。

ペンシルベニア大学バイオエンジニアリング学部のJason Burdick博士の研究室から、Amidio Kahanです。本日は、組織工学における3Dハイドロゲルへの細胞封入の手順について解説します。この手法を用いて、ハイドロゲルの組成と構造が封入された細胞の挙動に及ぼす影響を研究しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するために、PBSで光開始剤IrgaCure 2959（またはI2959）の0.5%重量溶液を調製します。混合し、37°Cの暗所で2〜3日間インキュベートします。

準備ができたら、シリンジフィルターを用いて溶液を滅菌し、室温で保存します。次に、Microsoft Excelなどの表計算ソフトを使用して、実演で示したポリマーと架橋剤の必要量を算出します。ここでは、アクリレート反応性基で機能化されたヒアルロン酸を使用します。

また、アミノ酸のシステイン、アルギニン、グリシン、およびアスパラギン酸を含む機能性接着ドメインを備えたペンダントペプチドの量を算出します。システインはポリマーへの係留に使用されます。ポリマー架橋剤およびペプチドの必要量が決定したら、それぞれを計量してエッペンドルフチューブに入れます。

計算用スプレッドシートを適宜調整してください。実際に得られたポリマーの質量を確認し、「ゲルの成形用モールドの準備」に進みます。カミソリの刃を使用して、個別に包装された滅菌済みチップの先端を切り取ってください。

1 mL使い捨てシリンジを用意します。フォトパターンをゲルに転写するためのモールドとして使用するため、切り口が平らになるようにカットしてください。最後に、キャップを開けた状態のシリンジモールドEORチューブおよびその他の必要資材を、バイオセーフティキャビネットに内蔵された殺菌灯の下に30分間置いて滅菌します。

滅菌が完了したら、実験器具の滅菌に続き、細胞の調製に進みます。フード内で作業を行い、ミカル型架橋に使用するポリマーに滅菌済みTEAを、自由ラジカル架橋に使用するポリマーに滅菌済みPBSをそれぞれ加えます。ペンダント部位のチューブに適合するバッファーを加え、ボルテックスで混合します。

ペプチド上のINE基のチオールを介してペン dant部位をアルキル化ヒアルロン酸に結合させ、ポリマーにペン dant部位を付着させるため、ペン dant部位をポリマー溶液に加え、パラフィルムで密封します。簡潔に述べると、ボルテックス処理後、混合しながら37°Cでインキュベートします。ペン dant部位が結合している間に、封入する細胞（human mesenchymal stem cellsまたはHMCs）をPBSで洗浄して準備します。

次に、室温でトリプシンを用いて1分間インキュベートし、トリプシンを除去した後、37 °Cでさらに5分間インキュベートします。その後、HMSC増殖培地を加えてトリプシンを中和し、細胞をプレート表面から剥離させます。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。

カウントした細胞を、各ゲルのセットに必要な数に分けて分注します。1 mLあたり1,000万個の密度で50 µLのゲルを3つのセットで作成する場合、150万個の細胞を個別のコニカルチューブに分注します。処理のタイミングがあるため、1つのセットで4つ以上のゲルを準備しないでください。

次に、細胞を500 RCFで6分間遠心分離します。遠心分離を行っている間に、室温でmical edition架橋用の重合ミックスを調製します。緩衝液を架橋剤に加え、適切な濃度に調整してください。

光開始フリーラジカル架橋を行うため、あらかじめ調製したI 2 9 5 9溶液をポリマー溶液に加えます。最終的な開始剤濃度が0.05% weightとなるように、ゲルセット全量の10%を添加します。これで、細胞と重合混合液のハイドロゲルへの封入準備が整いました。

まず、遠心分離した細胞から上清を吸引します。最初の吸引後、液体が静止するまで待ち、細胞ペレットを乱さないようにして、可能な限り多くの培地を再度吸引して除去します。気泡の混入を防ぐため、ポリマー溶液を用いて細胞ペレットを再懸濁します。

溶液をゆっくりと10回ほどピペッティングします。これにより、細胞が均一に分散されるはずです。mical型の添加反応では、口径の広いピペットチップを使用して、適切な量の架橋剤溶液をポリマーセルに添加します。混合し、ピペットを希望する個々のゲルの量に設定します。

溶液をピペットで吸い上げたり吐出したりして均質化し、シリンジチップ型に分注します。細胞を均一に分散させるため、この操作は迅速に行い、架橋させるために培養フード内で10～30分間インキュベートします。光開始剤によるフリーラジカル架橋については以下の通りです。

適切な量をシリンジチップ型に分注します。ラジカル架橋を行うため、シリンジを365 nmのUV光に10分間照射します。ACRL機能化ポリマーには、4 mW/cm²のUV光が一般的です。

UV光への曝露前に細胞が沈降するのを最小限に抑えるため、この工程は迅速に行います。架橋後、ゲルをインキュベーションおよび解析用の培地が入った組織培養プレートのウェルに投入します。ハイドロゲルの架橋は、逐次的に行うことも可能です。

まず、機能化染料であるメチル化ルミネを、ゲル内の最終濃度が 20 nanomolar になるように添加します。この染料は、ゲルのラジカル架橋領域に優先的に取り込まれるため、パターニングの可視化に役立ちます。次に、以下に示す、理論的な架橋密度の分率を得るためのmic型重合反応を開始します。

フリーラジカル架橋を行うには、Adobe PhotoshopやIllustratorなどのプログラムで設計し、透明フィルムに直接印刷したマスクを使用する必要があります。マスクの寸法は、円形のシリンジ上端と一致していなければなりません。滅菌済みのピンセットを使用して、滅菌済みマスクをゲル表面に直接貼り付け、光を照射してゲルを架橋させます。

ここでは、封入から1時間後のHAベースハイドロゲル内のHMCを示します。合成されたハイドロゲルは通常透明であるため、光学顕微鏡を用いて細胞の形態を可視化できます。同じ細胞について、封入から24時間後に蛍光生存死染色キットを用いて生存率を可視化しました。

生細胞の検出にはcalcium Mを、死細胞の検出にはatherium homodimerを使用し、95%以上の生存率を確認しました。また、alamar blueアッセイを用いて細胞増殖レベルを測定しました。これは、細胞がアッセイ試薬を代謝することで生じる色の変化によって測定されます。細胞染色は、分解性と接着性を備えたHAベースのハイドロゲルへの封入から7日後のH HMCsに対して、標準的な固定および透過処理を用いて行いました。

フルオレセイン標識phinを用いて細胞のアクチンを、dpiを用いて核を可視化します。ハイドロゲルマトリックス内の焦点接着を視覚化するために、cullinに対する免疫染色を行います。ラジカル重合させたHMSC封入HAハイドロゲルの脱水、パラフィン包埋、および切片作成を標準的なプロトコルに従って行い、組織学的染色を実施します。

培養から1週間後、ヘマトキシリンで核を、ASINで結合組織を染色し、グリコサミノグリカンを青色に染色しました。カプセル化された幹細胞の分化を定量化するために、リアルタイムPCRを使用します。バックグラウンドを差し引いた後、目的遺伝子の発現レベルは、構成的に活性なハウスキーピング遺伝子である受動的リファレンスシグナルと比較し、閾値蛍光に達したサイクル数によって決定されます。以上で、3Dハイドロゲルへの細胞のカプセル化方法と、ゲル内における細胞挙動の研究方法について説明しました。

これらの手順を用いる際は、滅菌バッファー溶液や試薬を長期保存するか、殺菌用UVランプで滅菌させることで、材料の完全な無菌性を確保することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。