光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

多光子蛍光退色後回復（FRAP）の手順は、自由に拡散する蛍光色素分子の試料を用いて容易に実証できます。まず、低強度のレーザービームを試料に照射し、レーザーの焦点体積内にあるD分子から基準となる蛍光レベルを生成させます。

次に、短時間の高強度レーザーフラッシュを照射し、焦点体積内の染料分子の一部を光退色させます。最後に、レーザービームを前の低強度レベルまで減衰させ、光退色した分子が外側に拡散し、焦点体積外からまだ蛍光を持つ分子が補充される際の蛍光をモニターします。得られた時間関数としての蛍光曲線から、拡散係数を算出します。

こんにちは、ロチェスター大学生物医学工学科のエドワード・ブラウン研究室のケリー・サリバンです。本日は、マルチフォトンの光退色後蛍光回復（FRAP）の実施方法について解説します。当研究室では、この手法を用いて、in vitroおよびin vivoの両方の生物学的システムにおける拡散の研究を行っています。

それでは始めていきましょう。まず、希望するレーザー波長を設定し、光電子倍増管（PMT）の前面に適切なフィルターを挿入します。次に、pcalセルの損傷を防ぐため、レーザー出力を200 milliwatts以下に調整してください。

pcalセルの上流に、4の字型に配置された2枚のミラーがあります。これらのミラーは、pcalセルを通過するレーザービームを調整するために必要かつ十分です。pcalセルバイアスコントローラーの電圧オフセットをゼロに設定し、レーザーが前面および背面ウィンドウの中心を通るようにpcalセル内のレーザー光路を調整してください。

図4の上流にあるミラーを使用してビームをフロントウィンドウの中央に合わせ、図4の下流にあるミラーを使用してビームをバックウィンドウの中央に合わせます。次に、pcalセル結晶の両端にかける電圧を最大値に設定します。適切な値は波長によって異なり、pcalセルの取扱説明書で確認できます。

pcalセルの上流にある図4のミラーを調整し、pcalセルからの出力パワーが最大になるようにします。次に、結晶にかかる電圧を0に切り替え、バイアスコントローラーの電圧オフセットを調整して、pcalセルからの出力パワーを最小限に抑えます。pcalセルに入射するレーザーパワーを、実験に必要な値に戻します。

次に顕微鏡へ移り、標準的な蛍光サンプルを用いて適切に視覚的なフォーカスを合わせます。ここでは、固定した蛍光花粉粒を使用しています。フォーカスが完了したら、顕微鏡を密閉し、pcalセル結晶にかける電圧を変更して、サンプルのイメージングに適したレベルまでレーザー出力を調整します。

最後に、照明を消してPMTの電源を入れます。標準サンプルの繰り返し画像スキャンを開始し、サンプルの鮮明な画像が得られるまで、pcalセルの下流にあるミラーを調整してください。それでは、サンプル内での焦点における安全なモニター出力の決定について見ていきましょう。

本ビデオでは、ガラススライドのくぼみに保持され、カバーガラスで蓋をされた水溶性染料のサンプルを使用します。サンプルの蛍光を発生させるために、レーザーを低出力ながら適切な強度まで減衰させます。顕微鏡を密閉し、PMTからの出力をフォトンカウンターに切り替えます。

照明を消し、PMTの電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアでポイントスキャンを開始します。フォトンカウンタの設定を行い、予想される蛍光回復時間よりも十分長い時間スケールで積分させ、適切な数のデータポイントを記録します。出力を上げ、さらに一連のフォトンカウントデータを取得します。

光子数の増加が著しく減少するように見えるまで、出力を上げ続けます。出力増加のプロット（電力の対数に対する光子数の対数の関数）において、傾きが2から逸脱した場合は、退色が起きていることを示します。

モニタリング中、このカットオフ値を下回る適切なモニタ電力を選択してください。次に、マルチチャンネルスケーラーとパルスジェネレータへの入力パラメータを決定します。パルスジェネレータについて説明します。

スケーラーのプリティーチ時間を予想される半回復時間の1～2倍に、ブリーチ時間を予想される半回復時間の10分の1に設定します。ビン幅をブリーチ時間の約半分に設定し、1レコードあたりのビン数を、選択したビン幅と1レコードあたりのビン数の積が予想される完全回復時間を上回るように設定します。プリブリーチ時間とブリーチ時間を加算し、パルスジェネレーターに戻り、プリブリーチおよびブリーチシーケンスの周波数を、ビン幅と1レコードあたりのビン数の積の逆数よりわずかに小さい値に設定します。

最後に、選択したモニター出力での信号強度に基づいて、スケーラーのスキャンあたりのレコード数を設定します。次に、モニター出力を安全なレベルに設定し、漂白出力を、モニター漂白テストで決定した漂白カットオフより約200 milliwatts高い値に設定します。これらの出力は、いずれもALセル結晶シールの異なる電圧として設定され、顕微鏡の照明が消灯します。

PMTの電源を入れます。イメージングソフトウェアでポイントスキャンを開始します。次に、パルスジェネレーターとスケーラーを始動させます。

得られた回復曲線を解析するために、3つの重要な点をマークします。漂白前の蛍光強度、漂白直後の蛍光強度、およびデータセット終了時の蛍光強度です。漂白前と直後の蛍光値を用いることで、半回復時間をより正確に推定できます。

次に、前のステップで概説したルールを使用して、preble bleachおよびbegin widthの持続時間の値を更新します。新しいカーブを作成し、得られるカーブが強い漂白（bleach）とスムーズな回復を示すまで、パラメータの微調整を続けます。漂白深さパラメータの対数をパワーの対数の関数としてプロットし、励起飽和を確認してください。

傾きが2から外れた場合は、励起飽和を示しています。強力な漂白が得られ、かつ飽和を引き起こさない漂白出力を選択してください。最終的に、適切なパラメータが決定したら、目的のサンプルの多光子蛍光回復後漂白（MP FRAP）曲線の測定を継続します。

次に、生のMP FRAPデータと、拡散係数を算出するためにフィッティングを行った正規化MP FRAP曲線の代表的な結果を示します。生のMP FRAPデータでは、強い退色とスムーズな回復が見られます。データに適合させるため、後半のデータを用いて完全回復を報告しています。まず、回復量を退色前の平均蛍光強度で正規化し、その後、非線形最小二乗法によるフィッティングを行います。

適切なモデルに関して、両方のデータセットは水溶液中のフルオレセインで取得され、拡散係数が得られました。文献と一致しています。以上で、多光子蛍光回復後光漂白実験の実施方法について説明しました。

この手順を行う際は、注意深く実験パラメータを設定することが重要です。特に、漂白時間、および漂白・モニタリングパワーを、プロトコルで定義された安全な範囲内に設定してください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。