接着細胞培養用の酸素挿入の作製と動作

低酸素インサートデバイスには、6ウェルプレートのウェルに適合する6本のピラーが備わっています。ガスはピラー底部にあるマイクロフルイディックネットワークを流れており、ガス透過性PDMSメンブレンを介して拡散することで、ガスネットワークと培養液を分離しています。このデバイスは、酸素源であるピラー底部のマイクロフルイディックネットワークから細胞までの拡散経路長を最小限に抑え、より迅速な酸素濃度の平衡化を可能にします。

このデバイスは、フォトマスクを用いた標準的なフォトリソグラフィーによるマイクロ流体ガスネットワーク設計によって決定される、細胞に曝露される酸素の空間パターンのより高度な制御を可能にします。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校バイオエンジニアリング学科のDr. David Edington研究室のSean Ardです。こんにちは、同じくEdington研究室のEllieです。

本日は、6ウェルプレート内のインビトロ細胞培養を異なる酸素濃度に曝露させるためのカスタムデバイスの作製、検証、および活用方法について解説します。当研究室では、この手順を用いて、酸素が創傷治癒、活性酸素種の生成、および細胞遊走に及ぼす影響を研究してきました。それでは始めましょう。

酸素供給インサートの作製を開始するため、ポリジメチルシロキサン（PDMS）の前駆体と硬化剤を10:1の比率で調製します。製造元の指示に従い、PDMS混合物を、標準的な6ウェル培養プレートの形状を模してあらかじめ加工されたデルラン型に注入します。75 °Cで一晩硬化させると、得られたレプリカ成形のピラーアレイが、酸素供給インサートを構成する3つのコンポーネントの1つとなります。次に、酸素供給インサートの2つ目の主要コンポーネントを作製します。

まずSU-8 2150をスピンコートしてSU-8マスターを作製します。シリコンウェハー上にフォトマスクを適用し、フォトマスクを通してSU-8をUV露光することで、マイクロチャネルの厚さが300 µmのマスターモールドを作成します。SU-8マスターの上にPDMSを流し込み、75 °Cで2時間キュアさせることで、最終的に各ピラーの底部にマイクロチャネルを形成するためのポジティブモールドを得ます。

デバイスの3番目の構成要素は、シリコンウェハー上にPDMSを500 RPMで10秒間、続いて900 RPMで30秒間スピンコートし、厚さ100 µmのメンブレンを作成することで作製します。PDMSはガス透過性があるため、このメンブレンを通じてマイクロチャネルに直接酸素を供給することが可能です。すべての構成要素の準備が整ったら、各接合面を1分間、酸素プラズマ処理にかけます。

ハンドヘルドプラズマデバイスを使用して、まず6つのマイクロチャネル構成部品をピラーアレイに接合し、次に各ピラーにガス入口および出口となる2つの穴を開けます。最後に、接合を容易にし気泡を排出させるため、メンブレンをマイクロチャネルの底部に接合します。プラズマ処理された表面をピンセットの先端を用いて約1分間圧着させ、各接合の間に1時間待機することで、デバイスが完全に接合され、校正が可能になるようにします。

デバイスの作製が完了したら、実際の実験で酸素供給インサートを使用する際に細胞が受ける酸素レベルを校正する必要があります。校正には、酸素によって消光する蛍光ルテニウム染料コーティングが施された、蛍光酸素センサーまたはfoxyスライドを使用します。foxyスライドは、6ウェルプレートの底面に適合するようにあらかじめカットされています。

カバースライドは、ウェル表面を可能な限り広く覆うようにカットしてください。カバースライドの厚さは約1 mmであるため、膜拡散に十分な距離を維持できるよう、装置を調整してください。

この距離は実験によって異なりますが、多くの場合、ハンドヘルドプラズマデバイスを用いて1mm以下にする必要があります。厚さ1mmのガラス顕微鏡スライドを、長さ約6mm、幅4mmに切り出し、デバイスの底面に固定します。デバイスは、スライド上の切り出されたポストの上に設置されます。

酸素消費量を検証するために、0.17 mmの拡散ギャップを形成するガラスカバースリップを使用することも可能です。酸素測定を行う6ウェルプレートの各ウェルに、室温の脱イオン水を3 mL加えます。デバイスをプレートに設置し、Metamorphソフトウェアを用いて、foxyセンサー上の希望する位置の数と場所を選択します。

酸素濃度を測定するためのスライドです。酸素ガスボンベと低酸素インサートデバイスの間にタイガンチューブを接続します。供給ガスの微量制御には、流量を 50 to 100 milliliters per minute に設定した精密流量調節器を使用します。

精密流量調節器が閉じていることを確認します。まずタンク上部のレギュレーターを開き、次に精密調節器を開きます。15分後、流量を毎分10から20の間に下げてください。

水中に気泡が生じるのを避けるため、その後1時間は流量値を注意深く監視し、必要に応じて調整を行ってください。システムが平衡状態に達するにつれて圧力降下が変化し、プレートおよびfoxyセンサーの画像をキャプチャするための流量が変動するためです。蛍光装置を備えたOlympus IX 71顕微鏡、Q Imaging社製のTiga CCDカメラ、およびSRVとMetamorpho画像取得ソフトウェアを使用します。顕微鏡には、励起波長475 nanometers、蛍光波長600 nanometersのfoxy対応蛍光フィルターであるOlympus 3 1 0 2 0が装着されています。

デバイスの平衡到達時間および酸素化の程度を検証するため、foxyスライド上の酸素濃度を測定する3つの地点を選択します。ガスのフローを開始する直前に、スライドの画像を撮影します。その後、ガスのデバイス内へのフローに合わせて、不均一性と酸素供給を確認するため、30分間にわたり10秒間隔で画像を撮影します。

チャネルの幅にわたって1 mm間隔で複数の点を設定し、MetaMorphを用いてウェル表面の酸素濃度を測定します。各位置の平均画像強度をエクスポートし、蛍光強度に依存する酸素濃度をプロットします。蛍光強度と酸素濃度の関係について、0〜10%のラインと10〜21%のラインに直線近似を行うことで、検量線を作成します。測定した各位置の生強度データはMetaMorphからエクスポートでき、Microsoft Excelなどの統計ソフトでさらに解析することが可能です。

デバイスの校正が完了したら、創傷治癒アッセイなどの実験を開始できます。実験の24時間前に、校正済みのインサートを121 °Cで15分間オートクレーブ滅菌し、その後のコンタミネーションを防ぐためにラミナーフロー文化フード内で操作してください。プレートのウェルに挿入する際の気泡発生を抑制するため、滅菌したPDMSインサートを無血清培地で24時間浸漬させます。6ウェルプレート内でMDCK細胞またはその他の付着細胞を100%コンフルエンスまで培養し、P200ピペットチップを用いて単層に直線的なスクラッチを作成します。このスクラッチにより、付着単層における創傷をシミュレートします。

単層を乱さないように細胞培地を吸引し、5 mLの培地で洗浄します。再度吸引し、ウェルに3 mLの無血清培地を満たします。気泡が入らないように注意しながら、デバイスをプレートにゆっくりと挿入します。

挿入時にデバイスを傾けることで、気泡を一方の端から排出させることができます。デバイスに過剰な圧力をかけないよう注意してください。PDMSが変形し、下層の細胞を押し潰してしまう可能性があります。プレートとデバイスを37 °Cに加熱された顕微鏡ステージ上に設置し、ソースガスボンベからデバイスの入口および出口ポートにチューブを接続します。

培養インキュベーターにはチューブを挿入するための穴がある必要があり、チューブを接続します。デバイスをインキュベーターに設置した後、前述と同様の手順でガスの流量を開始し、創傷治癒を評価します。前述の機器およびイメージングソフトウェアを用いて、20分おきに15〜18時間、細胞のタイムラプス画像を撮影します。T scratchの創傷測定アルゴリズムを使用して、所定の実験時間経過後の未治癒表面積を解析できます。ガスの流量を停止し、プレートを取り出し、必要に応じてさらなる細胞処理に進みます。低酸素インサートデバイスは、ここに示すように、0.5%oxygenまで安定させるのに2分未満で済みます。

デバイスのメンブレンウェル底部におけるギャップサイズは、平衡効率を決定する重要な要因であり、ギャップサイズが大きくなるほど、酸素濃度が定常状態に達するまでに時間を要しました。また、本デバイスは単一ウェル内での空間的な酸素供給を高度に制御できるため、複数の条件を形成させたり、ウェル表面にわたって周期的な酸素プロファイルを生成したりすることが可能です。MDCK細胞単層を10%または21%の酸素に曝露し、MATLABのスクラッチ傷創追跡アルゴリズムを用いて、傷創の表面積を経時的に解析しました。

合計17時間の過程で11時間が経過した時点で、10% oxygenに曝露した場合は元の創傷の6.87%が残っていたのに対し、21% oxygen下では創傷の64.4%が残っていました。ここに示されているように、どちらの酸素濃度においても、酸素濃度と創傷の開放面積の間には負の相関があります。本実験を通じて、スクラッチ創傷治癒アッセイのための低酸素インサートデバイスの作製、検証、および活用方法を説明しました。このデバイスは、研究室で占有するスペースが小さいことや、細胞表面における空間的および時間的な酸素濃度を極めて精密に制御できることなど、他の酸素供給システムに比べて多くの利点があります。

本装置は、in vitroの細胞培養における酸素や二酸化炭素などのガスの影響を研究するほぼすべての研究室で利用可能です。本手順を実施する際は、滅菌済みの装置と培地を一晩浸漬させ、実験中の気泡形成を最小限に抑えることが重要です。さらに、実験を開始する前にシステムを平衡状態にしてください。

これは、システム内の圧力が等しくなるにつれて流量が変化するためです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。