マウスの横大動脈狭窄

この手順では、まずマウスを麻酔し、無菌的な手術の準備を整え、加熱パッドの上に仰向けに配置します。PE 90チューブを用いて気管内挿管を行い、その後、マウス用人工呼吸器に接続します。次に、第2肋骨まで部分的な開胸術を行い、胸骨を牽引します。

横大動脈を確認し、その後、腕頭動脈と左総頸動脈の間で結紮します。肋骨を閉じ、続いて皮膚を連続縫合で閉じます。最後に、気管内チューブを抜去し、マウスを回復させます。

こんにちは。ベイラー医科大学分子生理学・生物物理学部のZander Wars博士の研究室のAngela Dal Medaです。本日は、マウスにおける大動脈横断的狭窄の手順をご紹介します。当研究室では、心肥大および心不全の発症メカニズムを研究するためにこの手法を用いています。

それでは、始めていきましょう。横大動脈狭窄（TAC）手術を開始する前に、術野を75% isopropyl alcoholで消毒します。ヒートパッドの電源を入れ、適切な温度に設定してください。

推奨されるシステムは、37 ± 1 °Cに維持される温熱療法パッドに接続されたゲーミング用循環水ポンプです。手術前に、ホットビーズ滅菌器で手術器具を滅菌してください。外科的手術には、以下の手術器具が必要です。

鈍端剪刀1本、粗い曲がった鉗子2本（または45度角度付き鉗子）、角度付きスプリング剪刀1本、胸部開創器、および持針器を用意します。出血に備えて、綿棒も手元に準備しておく必要があります。術野の準備が整い次第、マウスの挿管に進みます。

挿管の準備として、マウスを導入チャンバー内で麻酔し、バリカンを用いて首のラインから胸部中央までまで被毛を刈り取ります。マウスを加熱パッドの上に仰臥位で安置します。心拍数の急激な低下や突然死を避けるため、手術中は正常な体温を維持することが重要です。

マウスの爪床に圧力を加え、完全に麻酔がかかっていることを確認します。動物の前歯にラバーバンドをかけ、首を伸ばします。片手の曲がったピンセットを用い、もう一方の手で舌を優しく横に寄せます。気管にPE 90チューブを挿入します。

次に、気管内チューブをハーバード社製ボリュームサイクル式小型動物用人工呼吸器に接続します。人工呼吸器は、マウスの体重に応じて、呼吸数を1分間に125〜150回、1回換気量を0.1〜0.3 millilitersに設定して作動させます。術野内の皮膚をベタジン溶液、続いて70% alcoholで消毒します。術中の術野汚染を防ぐため、この手順を3回繰り返します。マウスの上に滅菌ドレープを掛け、術野のみを露出させます。

これから、本手術における横大動脈の結紮を行います。麻酔は、1.5〜2%のイソフルランと、毎分0.5〜1リットルの100%酸素を用いて維持します。マウスの爪床に圧力を加え、麻酔レベルが適切であることを確認してください。

トークン反射がないことを確認します。部分胸腔切開を行い、手術を開始します。胸骨の頭側端から第2肋骨のレベルまで切開します。

手術用顕微鏡を用いて、胸壁開創器で胸骨を牽引します。次に、45度角度付きの微細チップ鉗子を使用し、大動脈弓から胸腺と脂肪組織を慎重に分離します。横大動脈を確認後、無名動脈と左総頸動脈の間に、少量の6.0シルク縫合糸を配置します。

横大動脈に2つの緩い結び目を作り、27.5ゲージの鈍針の破片を横大動脈と平行に配置します。まず1つ目の結び目を針に沿って素早く締め、次に2つ目の結び目を締め、その後すぐに針を抜くことで、直径0.4 mmの狭窄を作成します。

横大動脈の結紮後、胸壁開展器を取り除き、人工呼吸器の流出路を2秒間遮断します。肺を慎重に再膨張させるため、6.0 proline縫合糸を用いて断続縫合で肋骨を閉じます。最後に、6.0 proline縫合糸を用いて連続縫合で皮膚を閉じます。

術後の鎮痛のため、マウスにブプレノルフィンを腹腔内投与します。手術後に脱水症状が見られる場合は、0.3から1 mLの滅菌生理食塩水を腹腔内投与します。

麻酔を徐々にオフの位置まで下げます。自発呼吸の兆候が見られたら、気管内チューブを抜去し、マウスを腹臥位にして加熱パッドの上で回復させます。横大動脈狭窄術から1週間後、マウスを再度麻酔し、横大動脈の結紮によって誘発された圧負荷の程度を判定します。

麻酔および体温の維持は、既報の方法に従って行います。20 megahertzのドップラープローブを、頸部の左右に45度の角度で当てます。頸動脈の血流速度を検出するために、コンピュータベースのドップラー信号処理装置を用いてドップラー信号を表示および保存します。

実験プロトコルで必要とされる圧力負荷の程度に応じて、右総頸動脈（RC）と左総頸動脈（lc）の血流比が一定の範囲内にあるマウスのみを、以降の解析の対象とします。例えば、中等度の圧力負荷では比率は5〜8となり、より強い結紮による重度の圧力負荷では比率は8〜10となります。一方、シャム手術個体では比率は約1になると想定されます。

野生型マウスにおけるTAC後の標準的な手術生存率は、約80～90%です。横大動脈の手術的結紮により、シャム手術群と比較して、右頸動脈と左頸動脈のドップラー血流速度比（RC/LC）は5～10倍になります。圧力負荷をかけたマウスでは、結紮の強さに応じて、1～2週間以内に心肥大が、6～8週間後に心拡大が起こることが予想されます。

マウスにおける横大動脈狭窄術の実施方法について解説しましたが、この処置を行う際は、正常な体温を維持し、出血を最小限に抑えることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。