アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

このビデオでは、末梢血単核細胞（PBMC）の刺激および染色の手順について解説します。多色フローサイトメトリー解析のため、全血から分離したPBMCを組織培養プレートに播種します。その後、細胞に化学的または生物学的な刺激を与え、免疫応答を誘導します。

刺激後、発現している表面マーカーに基づいた細胞型の特定を行うため、抗体カクテルを添加します。次に、細胞を透過処理し、別の抗体カクテルを添加して細胞内サイトカインの発現を検出します。その後、フローサイトメトリーにより解析を行い、PBMCの特定のサブセットにおけるサイトカインプロファイルを決定します。こんにちは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター免疫学部のDr. Jagan SAS研究室のAmy Courtneyです。

こんにちは。研究室のHongです。本日は、T細胞応答のマルチサイトメトリー分析についてご紹介します。私たちの研究室では、アカゲザルにおける細胞性免疫応答を研究するためにこの手順を用いています。

それでは、開始しましょう。まず、トリパンブルー染色除外法を用いて、Reuss Maca由来のpbmcの生存細胞数をヘモサイトメーターで測定します。作業はラミナーフローフード内で行ってください。

非特異的刺激のため、細胞を完全培地を用いて1 mLあたり1,000万細胞の濃度で懸濁し、96ウェル組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注する。次に、PMAおよびCINを含む培地を100 µL加え、全量を0.2 mLとする。このとき、最終濃度はPMA 50 ng/mL、CIN 500 ng/mLとする。陰性対照ウェルには、完全培地のみを100 µLずつ加える。その後、細胞を37 °C、5% CO2の加湿雰囲気下で1.5時間インキュベートする。

felden Aを最終濃度10 micrograms per milliliterになるように培養液に添加し、さらに4.5時間インキュベートします。felden Aは、刺激後の遠心分離で培地を除去し、200 microlitersの冷 flow wash bufferを加えて洗浄し、低速で遠心分離した後に、免疫染色による視認性を高めるためにgold G装置内でtrapp cytokinesに添加します。この洗浄操作を繰り返し、その後50 microlitersのflow wash bufferで再懸濁します。

再懸濁した細胞が入った各ウェルにおいて、表面マーカーの発現を染色する準備が整いました。製造元の指示に従って調製したLive Dead Fixable Aqua蛍光反応性染料を1 µL添加します。細胞をインキュベートしている間、4 °Cの暗所で30分間静置します。

マイクロチューブを用いて、染色に使用する染色溶液を調製します。まず、以下の成分を含む染色カクテルを適切に調製してください。力価調整済みの蛍光標識モノクローナル抗体（anti-CD3 PE SCI 7、anti-CD8 Alexa 700、anti-CD28 PerCP SCI 5.5、anti-CD95 APC、anti-CD4 Pacific Blue）およびInflow Wash Buffer。

次に、補正コントロールを準備します。これは、各蛍光標識抗体を単色染色として個別にチューブに調製し、各染色剤から他の検出器へのスピルオーバー係数を決定するために使用します。最後に、目的の試薬以外のすべての試薬を組み合わせて、蛍光マイナスワン（FMO）染色を準備します。これは、完全染色サンプルにおける自家蛍光レベルとデータの重複を確認することで、陽性集団と陰性集団の境界を決定するために使用します。

生死染色液で細胞をインキュベートした後、冷系のフロー洗浄バッファーで1回洗浄して過剰な染料を除去し、洗浄バッファーを吸引します。次に、調製した染色溶液を加えます。細胞を4°Cの暗所で30分間インキュベートします。

過剰な抗体を除去するため、染色した細胞を冷たいフロー洗浄バッファーで洗浄します。次に、100 µLのBD固定透過液を加え、10分以上放置します。細胞は4 °Cの暗所で最大24時間まで保存可能であり、その後、細胞内サイトカインの標識に進みます。

まず、100 µLの1X Perm Wash bufferで細胞を透過処理し、4 °Cの暗所で10分間インキュベートします。細胞のインキュベーション中に、以前と同様に1X Perm Wash bufferを用いて、染色用抗体、コンペンセーションコントロール、およびFMOコントロールを調製します。

細胞を10分間インキュベートした後、遠心分離して1x Perm Wash Bufferを除去します。適切な染色抗体を添加してください。その後、細胞と抗体を4°Cの暗所で60分間インキュベートします。

透過溶液で細胞を2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞をDPBSで調製した1% Paraform aldehydeに再懸濁し、細胞を固定します。細胞は4 °Cの暗所で、使用まで最大24時間保存してください。

細胞を染色した後、LSR II フローサイトメーターまたはCyan DP フローサイトメーターを用いて FACS を行います。その後、FlowJo または同様のソフトウェアを使用してデータを解析します。rhesus macaque における PBMC 組成は、FACS 解析を用いて決定されました。

この図は、代表的な個体における異なるT細胞サブセットの解析に用いたゲーティングスキームを示しています。まず、前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）を用いてリンパ球をゲーティングし、次にSSCおよびAQUA陰性集団に基づいて生存リンパ球を特定しました。続いて、CD3発現によりT細胞を特定し、CD3陽性T細胞集団内において、CD4陽性・CD8陰性およびCD4陰性・CD8陽性の集団を決定しました。

CD4陽性およびCD8陽性T細胞を、CD28およびCD95の発現に基づき、ナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞、およびエフェクターメモリーT細胞の異なるサブセットにさらに分画しました。この図は、非刺激およびpma・CIN刺激したCD4陽性T細胞およびそのサブセットにおける、インターフェロンγおよびIL-2の産生を示しています。

刺激によって誘発されるサイトカインプロファイルが、各サブセットで異なることに注目してください。ここでは、PBMCのマルチカラーフローサイトメトリー解析の実行方法を解説します。

この手順を行う際は、単色補正コントロールと蛍光マイナスワン（FMO）コントロールの両方を設定することが重要です。フローサイトメトリーデータの適切な解析には、これら両方のコントロールが必要です。補正コントロールの選択に関する詳細については、書面によるプロトコルをご参照ください。

また、蛍光標識抗体を使用する際は、光曝露から保護するためにサンプルを遮光することが重要である点にご留意ください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。