赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

ヘマグルチニン法を用いて血清の反応性とタイターを決定します。凝集反応とは、可溶性抗体と粒子状抗原との間で起こる反応です。これらには、細胞や担体分子が含まれます。

キャリア表面のエピトープにより、抗体が結合してキャリア同士を架橋することで、抗原抗体複合体と呼ばれる複雑な格子状構造が形成されます。血球凝集は凝集の一種であり、粒子状抗原として機能する赤血球に抗体が結合することによって起こります。赤血球は容易に入手でき、かつ結果を肉眼で容易に確認できるため、標的として有用です。

血清サンプルを段階希釈し、96ウェルU底プレートに分注します。次に、赤血球懸濁液を加えます。高濃度の抗体が存在する場合、赤血球との結合が起こり、大きな格子構造が形成されます。

この格子状の構造が重力によって沈降すると、U底プレートの形状に沿って広がります。上から見ると、赤血球が広範囲にわたるシート状に広がっているのが観察されます。これがヘマグルチニン反応陽性です。

抗体価が低い場合、格子構造が形成されず、赤血球はU底プレートの形状に従って底辺に集まり、小さなペレットを形成します。これは血球凝集反応陰性です。この図は陽性反応を示しています。

細胞は沈降するにつれて格子状に形成され、U底プレートの形状に沿って配置されます。左右の画像は上面からの視野であり、赤血球が広範囲にわたってシート状に広がっているのが見えます。中程度の量の抗体が存在する場合、一部にレター形成（letters formation）が観察されます。

血球凝集法を用いることで、既知の抗原に対する異なる血清サンプルの反応性を試験することも可能です。また、血清サンプルのタイター（抗体価）を決定することもできます。タイターとは、陽性反応が認められた最後の希釈倍率のことです。

通常、血清サンプル中の抗体濃度が高ければ高いほど、タイターは高くなります。この図は陰性の血球凝集反応を示しています。赤血球を架橋させるのに十分な抗体が存在していません。

細胞が重力によって沈降すると、ウェルの壁面に沿って滑り落ち、底面に密なペレットを形成します。右の図は、赤血球を上方から見た様子を示しています。この実験では、U底の96ウェルプレートが1枚必要になります。

平底プレートでは細胞がペレット状に沈降せず、解析が不可能になるため、必ずU底プレートを使用してください。ピペットを用いて、各列のウェルに50 µLのテスト血清、1%のRiva細胞懸濁液、および1回分のverone緩衝生理食塩水溶液を分注します。1から12まで、50 µLのroal緩衝生理食塩水を分注してください。

これを希釈液として使用します。次に、50 µLの血清をウェルA1に入れます。これが2倍希釈の最初の検体となります。

パーペットを用いて、血清サンプルを十分に混合してください。混合後、ウェルA1から50 µLを分注し、ウェルA2に移します。これにより2倍希釈を2回繰り返すことになり、最終的に4倍希釈となります。

ウェル3から11までを用いて、この希釈系列を続けます。ウェル12はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の陰性対照であるため、血清は加えないでください。次に、十分に混合した1%のRiva細胞懸濁液を用意し、ウェルA1からウェルA12まで50 µLずつ分注します。

細胞を添加した後、プレートに蓋をし、プレートを軽く叩いてサンプルと細胞が十分に混合するようにします。次に、37 °Cで60分間インキュベートします。加湿インキュベーターの使用が適切です。

60分間のインキュベーション期間中に、抗原抗体反応が起こり、細胞が沈降し始めます。ご覧いただいているビデオ映像は、この60分間全体のタイムラプス写真です。これはウェル5から10のクローズアップです。

すでに、今回のVBSコントロールである12番ウェルを確認しました。細胞が密なペレットを形成しており、アッセイが適切に機能したことが示されています。5番と6番のウェルは、正の血球凝集の例です。

ウェル7は中間的な凝集結果の例であり、ウェル8、9、および10は血球凝集陰性です。この結果に基づき、陽性反応が観察された最後のウェルであるウェル7の希釈倍率に基づいてタイターを決定します。