安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

E Coli RP 4 37を化学走性装置に導入し、定義された空間的な濃度勾配にさらします。チャンバーに進入した細胞は、濃度勾配の中間点に到達します。シグナルが誘引物質として認識されるか、あるいは忌避物質として認識されるかに応じて、細菌は濃度勾配を上昇または下降するように迅速に移動します。

こんにちは、テキサスA&M大学の分子システムバイオテクノロジー研究室および化学工学科のデレク・エングラーです。本日は、マイクロ流体デバイスを用いて細菌の走化性を調査する手順について説明します。私たちの研究室では、この手順を用いて、硫酸ニッケルの濃度勾配におけるE. coli RP437の移動について研究しています。

それでは始めていきましょう。流路層と制御層は、SU-8マスターからポリメチルSUBOXANEまたはPDMSをレプリカ成形して作製します。この手順を開始するには、PDMS前ポリマーと架橋剤を10対1の重量比で混合します。

気泡がなくなるまで、デシケーター内で混合物を1時間脱気します。PDMS混合物の準備ができたら、SU-8マスターをシャーレに入れ、目的の厚さになるように混合物をSU-8マスターの上に注意深く注ぎます。PDMSとSU-8マスターモールドが入ったシャーレを80 °Cで2時間加熱し、PDMSを硬化させます。

2時間後、ホットプレートから硬化したPDMSで覆われたSU-8マスターを取り出し、SU-8マスターからPDMSモールドを剥がします。目的の構造がPDMSモールド内に埋め込まれています。20ゲージの鈍端針を用い、グラジエントジェネレーター、細胞入口、および細胞出口へのチューブを接続するための穴を、PDMSモールドに4箇所開けます。これで、PDMSデバイスを組み立てて接合させる準備が整いました。

まず、ガラス顕微鏡スライドをイソプロパノールで洗浄し、Airstreamで処理します。次に、プラズマエッチャーを用いて、PDMSモールドとガラススライドを約30秒間酸素プラズマにさらします。PDMSモールドをガラススライドに密着させ、密着させたスライドとPDMSモールドをホットプレート上で65 °Cで15分間加熱します。

PDMSデバイスを組み立てるには、カミソリを使用して、顕微鏡のセットアップに応じて必要な長さにチューブを45度の角度で切断します。次に、ピンセットを用いて、チューブの一端をデバイスに開けられた4つの穴のいずれかに挿入します。

チューブのもう一方の端に、30ゲージの鈍端針のハブを挿入します。残りのすべての穴に対しても、チューブと針のハブの挿入を繰り返します。3 mLのシリンジに、1 mLのchemo taxes、バッファー、またはCBを充填します。

シリンジ内から空気を除去するように注意してください。ピペットを用いてアウトレットニードルハブにCBを加え、ニードルハブを軽く叩いて気泡を除去します。3 mLシリンジの先端からCBを少量押し出し、空気が入らないようにシリンジをニードルハブに接続します。

残りのニードルハブがすべてCBで満たされるまで、デバイスにCBを押し込みます。これにより、気泡の大部分が除去されます。次に、テスト対象のケモエフェクターを適切な濃度で含むCBを、500 µLシリンジ2本に充填します。

シリンジの内容物を少量押し出し、針のハブ部分に液滴があることを確認してシリンジを取り付けることで、気泡の形成を取り除き、運動性の高い細菌を準備します。化学走性実験では、GFP発現プラスミドを保持するe coli RP 4 37を、トリプトンブロスまたはTB培地を用い、32 °Cで振盪しながら一晩培養します。翌日、この一晩培養液を用いて、250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れた20 mLのTB培地に接種し、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が約0.05になるように調整します。

細胞のOD 600が約0.35から0.45になったとき、32°Cで振盪培養します。低速遠心分離で細胞を回収し、チャネルの中央で予想される濃度の化学 effector を含むCBを用いて、OD 600が約0.35になるように細胞を再懸濁します。最後に、GFP発現生細胞に、OD 600が約0.35のRFP標識死細胞を添加します。

これらの死細胞は、細胞の移動が流動の影響によるものではないことを確認するための内部コントロールとして使用します。これで、化学走性実験のためにマイクロ流体デバイスにロードする準備が整った細胞懸濁液が完成しました。化学走性実験を開始するには、細胞注入用ニードルハブからCBを一部取り除き、細胞懸濁液で満たします。

再懸濁した細胞を50 µLシリンジにゆっくりと吸い込みます。鞭毛がせん断されると運動性が低下するため、この操作は慎重に行ってください。以前に示した方法に従い、シリンジの内容物を少量押し出して滴を作り、その滴をニードルハブ内の液体に接触させながら50 µLシリンジをインレットニードルハブに装着します。その後、画像取得用の高速カメラを備えた蛍光顕微鏡のステージ上にデバイスを設置します。

両方の入口シリンジをシリンジポンプにセットし、グラジエントが形成され、細胞がチューブ内を流れるようにフローを開始します。細胞が化学走性チャンバーに入ったら、システムが安定するまで約20分間待ちます。イメージングを行う前に、チャンバーの長手方向に沿った異なる位置で、生存細胞の緑色蛍光および死細胞の赤色蛍光画像を収集します。

通常、各位置において3秒間隔で100枚の画像を収集します。取得した蛍光画像は、Image Jやmetamorphなどの市販の画像解析プログラム、またはMATLABで記述した簡単なコードを用いて解析することが可能です。本例では、MATLABコードを使用します。

まず、この閾値ピクセル強度を設定して画像内の背景ピクセルを除去し、閾値未満の強度を持つすべてのピクセルを削除します。これにより、ノイズを最小限に抑えることができます。解析では、死細胞の位置を用いて画像の中心を決定します。

これは、細胞が化学走性チャンバーに進入した位置であり、遊走が全くない場合に検出される位置を表します。次に、画像内の生細胞を特定し、画像をチャンネルに分割して、各チャンネル内の生細胞数を決定します。我々の先行研究では、幅 50 µm の化学走性チャンバーを、それぞれ幅約 16 µm の 64 個のチャンネルに分割しました。

すべての画像に対してこれらの手順を繰り返した後、全画像にわたる各チャネルの総細胞数を算出します。これにより、実験期間中に各チャネルで検出された総細胞数が得られます。次に、遊走方向を示す化学走性分画係数（CPC）を計算します。

以下の手順に従い、死細胞の高濃度側（右側）に位置する各細胞に+1の乗数を、低濃度側（左側）に位置する各細胞に-1の乗数をそれぞれ割り当てます。これらすべての乗算値を合計し、検出された全細胞数で正規化します。これにより、細胞が移動した距離に応じて移動の重みを付ける化学走性移動係数（CMC）を算出します。

最高濃度側の最も遠い位置（チャネル64）まで移動した細胞には+1の重み係数を、高濃度側へ半分まで移動した細胞には+0.5の重み係数を与えます。また、最低濃度側の最も遠い位置まで移動した細胞には-1の重み付けをします。これらすべての重み付けされた細胞数の合計を求め、それを細胞数で正規化することでCMCを算出します。

このグラフは、フルオレセインイソチオシアネートを用いてマイクロ流体デバイス内に形成された線形濃度勾配またはプロファイルを示しています。この図では、青色と黄色の色素を用いて濃度勾配の形成を実証しています。細胞導入部はCAであったため、そこを通過する流れはなく、青色から黄色までの範囲の色が形成されていることがわかります。

これらは、デバイス内でe coli RP 4 37を0から100 µMのL-aspartateまたは0から225 µMの硫酸ニッケルの濃度勾配にさらした、代表的な化学走性実験の擬似カラー画像です。生きた緑色の細菌がL-aspartateに向かって、あるいはニッケルから遠ざかって移動する様子を、30分間にわたって2.5秒ごとに撮影しました。赤色で示されている死菌は、デバイス内での流れによる影響を評価するためのコントロールとして使用されました。

勾配がない状態におけるマイクロ流体デバイス内のRP 4 37の空間分布を、アスパラギン酸勾配および硫酸ニッケル勾配に対する応答と比較してこのグラフに示しています。ここでは、硫酸ニッケル勾配におけるe coli RP 4 37の化学走性をモニタリングする方法を説明しました。この手順を行う際は、高い運動性を有するサブポピュレーションを利用できるよう、細胞のボルテックス処理を最小限に抑えることが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。