小脳性運動失調のマウスモデルを評価するための単純な複合表現型のスコアリングシステム

疾患の重症度および進行を評価するための複合表現型スコアリングシステムを開発しました。小脳失調症のマウスモデルにおいて、「レッジテスト」、「後肢のクラスピング」、「歩行」、「後弓反張」の4つの異なる試験を実施し、各試験を0から3の尺度で評価して、合計スコアを0から12までで算出します。これら4つの指標のうち、レッジテストは協調運動を直接的に測定するために行われます。

後肢のクレスピング（clasping）は、多くの神経変性マウスモデルにおける疾患進行の指標となります。歩行（Gait）は、協調運動および筋機能の尺度です。後弯症（Kyphosis）は、頚胸椎領域における脊椎の湾曲であり、運動系および脊髄小脳変性のマウスモデルに一般的です。各テストを実施し、スコアを記録します。

4つのスコアの合計の平均値、または平均複合表現型スコアを各マウス群について算出し、プロットします。このプロトコルを異なるマウスモデルに適用する場合、まず個別のテストスコアを分析し、上述の4つの測定指標の最適な組み合わせを決定することが重要です。この特定のプロトコルは、脊髄小脳失調症のマウスモデルにおいて、罹患個体と非罹患個体を判別すると同時に、疾患表現型の進行を定量化するように設計されています。

タイプ7。こんにちは。ワシントン大学神経病理学部のGwen Garden博士の研究室のステファニー・ファーです。本日は、小脳失調症のマウスモデルにおける疾患重症度を評価するための、簡便かつ高感度な方法をご紹介します。

当研究室では、脊髄小脳変性症7型（SCA7）のマウスモデルにおける表現型の差異を定量化し、SCA7の表現型の経時的な進行を追跡するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。レッジテスト（ledge test）は、小脳性失調症やその他の多くの神経変性疾患で損なわれる協調運動を直接的に測定する方法です。

バイアスを避けるため、ヒトの小脳性失調の徴候と最も直接的に比較可能な指標を測定します。評価を行う実験者は、動物の遺伝子型を知らされていない状態でなければなりません。評価中、個々の測定項目は0から3のスケールでスコア付けされ、0は表現型の欠如を、3は最も重篤な発現を表します。

まず、マウスをケージから持ち上げ、ケージの縁に置きます。マウスがケージの縁に沿って歩き、ケージの中へと降りる様子を観察してください。野生型マウスは、バランスを崩すことなく縁に沿って歩き、前肢を用いてスムーズにケージの中へ戻ります。

この行動にはスコア0を割り当てます。マウスが縁に沿って歩いている際に足を踏み外したが、それ以外は協調性が保たれているように見える場合は、スコア1となります。後脚を効果的に使用できていないか、スムーズにケージの中へ降りられない場合がこれに該当します。

歩行中、あるいは自ら降りようとした際に、縁から落下したか、あるいはそれに近い状態になった場合、または震えて全く動かなくなった場合は、スコア2とします。促しても反応がない場合は、スコア3とします。正確な測定を行うため、レッジテストを3回実施し、そのスコアを記録してください。

次に、後肢のクラスピング（clasping）のスコアリング方法を確認しましょう。後肢のクラスピングは、特定の小脳性失調症を含む、神経変性の多くのマウスモデルにおける疾患進行の指標となります。評価を開始するには、尾の基部付近を掴み、周囲の物体に当たらないよう十分な空間を確保して持ち上げます。

後肢の位置を約10秒間観察します。後肢が常に腹部から外側に開いている場合は、スコアを0とします。懸垂している時間の50%以上にわたって、片方の後肢が腹部に向かって引き寄せられている場合は、スコアを1とします。

懸垂時間の50%以上の時間、両後肢が腹部に向かって部分的に屈曲している場合は、スコア2とします。後肢が完全に屈曲し、懸垂時間の50%以上の時間、腹部に接触している場合は、スコア3とします。この試験を3回行い、後肢のクラスピングスコアを記録してください。

それでは、歩行能力の評価方法について見ていきましょう。歩行テストは、協調性と筋肉機能の指標となります。テストを開始するには、マウスをケージから出し、頭を研究者とは反対方向に向けた状態で、平らな面上に置きます。

マウスが歩行する様子を後方から観察します。マウスが通常通りに歩行し、腹部が地面に触れることなく四肢すべてで体重を支え、かつ両後肢が均等に機能している場合は、スコア0とします。歩行中に震えが見られる、または跛行しているように見える場合、あるいは足先がわずかに外側に向いている場合は、スコア1とします。

激しい震え、ひどい跛行、骨盤の低下、または移動中に足が体からより大きく外側に開く様子が見られる場合は、スコア2と判定します。マウスが前進困難で腹部を地面に引きずる場合は、スコア3とします。マウスのGAを3回観察し、スケートスコアを記録しました。

それでは見てみましょう。後弯症テストについて説明します。後弯とは、脊髄に見られる特徴的な背面の湾曲のことです。これは、マウスモデルにおける脊髄小脳失調症を含む、運動系に関わる神経変性疾患の一般的な症状です。

これは、神経変性に起因する脊髄筋の筋緊張低下によって引き起こされます。まず、マウスをケージから取り出し、平らな面に置きます。マウスが歩く様子を観察してください。

マウスが歩行時に容易に脊柱を伸ばすことができ、持続的な後弯症が見られない場合は、スコア0点とします。軽度の後弯症が見られるものの、脊柱を伸ばすことができる場合は、スコア1点とします。脊柱を全く伸ばすことができず、軽度ながら持続的な後弯症がある場合は、スコア2点とします。

マウスが歩行中または静止中に顕著な後弓反張（キフォシス）を維持している場合、スコア3とします。マウスの後弓反張スコアを3回観察してください。その後、マウスをケージに戻し、後弓反張スコアを記録します。

以下は、Flocked SCA 7 92 Qとして知られている、小脳共済型脊髄小脳変性症7型（SCA7）モデルのmurnトランスジェニック・スパイノの複合表現型評価の代表的なグラフです。4つの指標のスコアをマウスごとに合算し、各週齢の両方の遺伝子型について平均複合スコアを算出しました。ここでは、Fluxed SCA 7 92 Qマウスが、非トランスジェニックの同腹個体とは有意に異なる、進行性のSCA7表現型を示すことがわかります。重要な点として、このように時間とともに表現型スコアが増加することは、ヒトの疾患の進行性と一致しています。

小脳失調症のマウスモデルにおいて、疾患の重症度および進行を評価するために複合表現型スコアリングシステムを利用する方法を解説しました。この手順を行う際は、上述した4つのテストすべてにおいて肥満が混同要因となることに留意することが重要です。個々のテスト結果を個別に分析し、使用するマウスモデルに最も適した複合表現型スコアリングシステムにおける最適な組み合わせをまず決定することもあります。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っています。