外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

本記事では、新鮮に分離したヒト気管支セグメントからのヒト気管支上皮細胞の増殖および拡大のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、コーディングとスクラッチング、100 mm培養プレート、気管支組織の修復、気管支組織移植の説明、繊毛を形成して増殖するヒト気管支上皮細胞の継代、トランスウェル上のヒト気管支上皮細胞の5つのセクションで構成されています。開始する前に、すべての手順は生物学的安全キャビネット内で行うことに注意してください。

特に断りのない限り、「材料、試薬および調製」セクションを確認し、基本的な準備が整っていることを確認してください。以下のコーティング、ストック溶液の調製、培養、培地、解離液、コーティングおよびスクラッチ操作は、100 mm培養プレートを用いて事前に行ってください。

すべて無菌状態を維持してください。滅菌済みの100 mm培養プレートとコーティング溶液を用意します。BSTピペットで2 mLのコーティング溶液を100 mmプレートに加え、プレートの底面がコーティングされるように旋回させます。

コーティング溶液がプレートの底面を均一に覆っていることを確認してください。残った溶液をピペットで回収し、2枚目の100 mmプレートのコーティングに使用します。必要な枚数分、この操作を繰り返します。

必要となるプレートの数は、組織外植片の数によって異なります。実演通りに、コーティング液がプレートの底面を均一に覆うようにしてください。

プレートをカバーで閉じます。インキュベーター内で1〜2時間乾燥させ、気管支組織の播種（explant）に使用する前に、アクセス溶液を吸引除去します。未使用のコート済み培養プレートは、滅菌バッグに入れて4°Cで保存し、後で使用することができます。

70%エタノールでスプレー洗浄した小型の鋭い鋏、メス、およびピンセットを使用し、BSC内で、メスで強く押し付けるようにして、1プレートあたり少なくとも4箇所の深く小さなXS状の切り込みをプレートに付けます。切り込みが十分に深くない場合、組織片が固定されず、浮き上がってしまいます。BSCの外で、組織をP3ディッシュに入れます。単離したヒト気管支組織をBSSで十分に洗浄します。

気管支片を開きます。組織をBSに取り出し、冷やした1%抗生物質・抗真菌剤含有DMEM/F-12を入れた滅菌済みの100 mm組織培養プレートに移します。鋭い小型の剪刀を用いて、組織を2〜3 mmの立方体状に細切します。

ピンセットを用いて、切り出した組織を各Xの中心に1片ずつ配置し、押し付けてください。組織片またはX外植片がプレートに密着するまで、数秒間静かに保持します。その後、完全培地を10 mL慎重に加えます。培地を加えた後に組織が浮いた場合は、ピンセットで組織をXの溝に押し込むか、新しくXを作成してください。溝が十分に深くない場合は、新しくXを作成する必要があるかもしれません。

プレートをインキュベーターに入れ、組織が移植可能になるまで3〜4日ごとに培地を交換します。組織の周囲に上皮細胞が十分に増殖し、1〜2 cmの範囲を覆うまで、およそ4週間かかります。100 mmのコーティング済みスクラッチプレートを使用してください。

一部の組織の説明片（explant）は成功しない可能性があるため、プレートの数は移植する組織片の数に応じて決定します。あらかじめコーティングし4°Cで保存したプレートを使用する場合は、使用前に室温に戻してください。ピンセットを用いて、元のプレートから組織を慎重に取り出し、新しいプレートの中心軸上に配置して軽く押さえます。外方成長（outgrowth）が見られない組織は廃棄してください。

組織をプレートに接着させます。数秒間、培地を添加してインキュベートします。Xの解説で前述した手順に従って添加します。

各100 mm組織培養プレートにつき、トリプシンおよびEDTAストック溶液を2 mL使用します。ストック溶液を滅菌済みの0.01 M PBS 6 mLで希釈します（ストック溶液2 mLに対しPBS 6 mL）。これにより、最終濃度はトリプシンが250 µg/mL、EDTAが100 µg/mLとなります。外植片を新しいプレートに移動させた後、1〜2 cmの細胞リングがあるプレートから培地を吸引除去します。

温めた希釈後のdripsおよびedt溶液を8 mLずつ、100 mmプレートに加えてください。その後、37 °Cのインキュベーターに3〜15分間置き、頻繁に確認してください。

トリプシンを作用させすぎると、細胞が損傷します。顕微鏡下でプレートを確認し、ほとんどの細胞が剥離したことを確認してください。細胞は、8倍率の拡大図に示すように、円形になって剥離します。トリプシン・EDTA溶液を不活化させるため、1プレートあたり10% FBS含有培地を加えてください。

すべてのプレートの液量を1本のチューブにまとめるか、組織ごとに別々のチューブにまとめます。Hema Cytometerを用いて細胞数を計測します。100 Gで5分間遠心分離します。チューブの底に細胞ペレットが形成されるので、細胞ペレットを完全培地で再懸濁し、目的の細胞濃度にします。

T 75フラスコ1本あたり200万から300万個の細胞を播種し、必要に応じて完全培地を加えます。インキュベートし、培地を交換します。3〜4週間ごとに、細胞はT 75フラスコ内でサブコンフルエントまで増殖します。

約4週間後、細胞を剥離して拡大培養するか、または老化を防ぐためにコンフルエンスに達する前に使用してください。まず、トランスウェルの透過性膜を準備します。24ウェルマルチウェルプレートに適合する6.5 mmのインサートを使用してください。

メンブレンの両側に培地を添加します。底部に0.6 mL、上部に0.1 mLを加えてください。その後、細胞培養インキュベーター内で1時間インキュベートします。

メンブレンの両側から培地を慎重に除去します。まず基底側の液量から取り除きます。注意深く行わないと、メンブレンを容易に損傷させる可能性があるためです。したがって、推奨される液量を用い、培養インサートの壁面に沿って培地をピペットで吸い出してください。

そうしないと、培地が他のウェルに漏れ出し、細胞の播種に影響します。透過性サポートのプレインキュベーション後、細胞懸濁液を慎重にピペットで吸引し、6.5 mmウェルの膜の頂端側に0.1 mLずつ分注します。次に、膜の基底側に0.6 mLの培地をピペットで加えます。

10日間、細胞の頂端側と基底側の両方から給餌を行います。十分に分化した培養状態を確立するため、培地を週に2回交換してください。実演した方法を用いて、基底側の容量を除去します。

まず、上層の培地を交換し、メンブレンの基底側に0.6 mLの培地を添加します。この方法は、細胞のメンブレンへの接着を促進し、細胞が長時間空気にさらされるのを防ぎます。迅速に培地を交換し、インキュベーターに戻してください。

10日目に、AAL培地を除去し、メンブレンの基底側の培地を0.6 mL交換して、気液界面（ALI）を形成させます。細胞を気液界面で6週間維持し、培地交換を週2回行います。気液界面の形成から4週間後に、線毛細胞が出現し始めます。

気液界面。細胞は繊毛細胞へと均一に分化します。耳の気液界面を作成してから6週間後。

摘出物および移植片由来の健康な上皮細胞を含むヒト気管支セグメント。本研究では、気管支組織の摘出物からの培養に成功した例は9組織中8組織であった。摘出物培養の1例に感染が見られたが、上皮細胞のリングは3〜4週間で半径1〜2 cmに達した。

成功したX外植片は最大6回まで再培養されました。すべての成功した培養では、移植開始から48時間以内に細胞遊走の証拠が認められました。また、B細胞に示されているように、X外植片は、Bに示されるこれらの上皮細胞に特有の石畳状の外観を呈しています。以降の図において、外植片由来の細胞およびカバーガラス上に播種した細胞のサイトシン調整物の免疫染色を行ったところ、すべての細胞が上皮特異的なサイトケラチン陽性であることが明らかになりました。ここでは、T 75フラスコ内でサブコンフルエントまで増殖させたヒト気管支亜培養細胞を示しています。石畳状の外観に注目してください。

ヒト気管支細胞のサブカルチャーにおいて、ケラチンおよびE-カドヘリンに対する一様な陽性免疫染色が認められました。他の細胞型に対する特異的抗体を用いた免疫染色では、線維芽細胞、間葉系細胞、または内皮細胞による培養物の汚染を示す兆候は見られませんでした。詳細は、本文中の図5およびその凡例を参照してください。透過性ポリエステルメンブレンまたはトランスウェル上で培養された細胞は、本法で示したように、気液界面で繊毛上皮へと分化しました。本法で示したものとは異なる形態の細胞が現れ始めた場合は、細胞およびその移植物を廃棄してください。本プロトコルでは、ヒト原代気管支上皮細胞の培養および拡大のための詳細な方法を提示しました。

ヒト肺疾患メカニズムの重要なパスウェイの特定や、新規薬剤の毒性および薬理学的スクリーニングには、ヒト細胞を用いた研究が必要です。本書で解説する手法が、外植片からのヒト気管支上皮細胞の培養および、これらの細胞を研究システムに導入する一助となることを願っております。ご活用いただき、ありがとうございます。