二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

このビデオでは、光学散乱顕微鏡を用いて、アポトーシス中のミトコンドリア断片化を定量化します。本プロトコルにおいて、光学散乱顕微鏡は通常蛍光を必要としませんが、検証目的で蛍光画像を取得します。イメージングシステムのセットアップ後、細胞をMIT tracker greenで標識し、staurosporinで処理してアポトーシスを誘導します。

2時間以内に細胞小器官の配向の変化を検出するために、光学データを取得します。ミトコンドリア断片化の開始は、細胞内粒子の配向度の低下を示す光学散乱データを用いて測定できます。その後、光学散乱データとミトコンドリアを含む蛍光領域を相関させることで、データの検証を行います。

こんにちは。ラトガース大学生物医学工学科、バイオオプティクス研究室のナダ・ブスタニです。同じくバイオオプティクス研究室のロブ・パックです。そして、同じくバイオ研究室のディーンです。本日は、蛍光染料に依存しない手法を用いて、細胞内小器官の形態学的ダイナミクスを定量化する手順についてご紹介します。

当研究室では、アポトーシス（プログラム細胞死）における細胞内構造の動的な変化を研究するために、この手法を用いています。それでは、手順を開始しましょう。まず、手袋を着用した手を70% ethanolで滅菌します。

次に、調製した100 nMのMitoTracker Greenストック溶液と、あらかじめ温めておいたBAEC細胞培養培地を、消灯したフード内に設置し、すべての表面を滅菌します。続いて、カバーガラス上に細胞を播種した6ウェル培養皿をフード内に設置します。真空ラインに接続されたペーストピペットを使用してください。

ウェルから細胞培地を除去します。次に、細胞（ミトコンドリア）を標識するため、各ウェルに標識培地を2 mLずつ直ちに追加します。室内の直射光にさらされないよう組織培養プレートにカバーをかけ、速やかに細胞をインキュベーターに戻します。

細胞を37°Cで45分間インキュベートします。その間に光学系のセットアップを行い、まず水銀アークランプを点灯させます。次に、コンピューター、顕微鏡カメラ、およびレーザーを起動し、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）をスピニングディフューザーに装着します。

次に、顕微鏡の接眼レンズを覗き、光学的な導入（ launched）が調整されているかを確認します。視野がレーザー光で明るく照らされているはずです。サンプルをロードするには、63 x 油浸対物レンズを完全に下げた状態で、レンズの上に浸漬油を1〜2滴落とします。

次に、gradiと呼ばれる10 µm間隔の格子線が描かれたスライドをステージに設置し、対物レンズを上げてオイルでピントを合わせます。次に、コンデンサー視野の六角形の縁に焦点を合わせます。中央ケーラー照明に調整されるまで操作を停止してください。

六角形の縁を接眼レンズの中央に配置し、ピントを鋭く合わせます。次に、コンデンサー絞り開口調節ノブを使用して、コンデンサー絞り開口を視野の中央に合わせます。IP labを起動し、カメラを操作するための設定を入力してください。

カメラがフレーム転送モードに設定されていることを確認します。「acquire focus」コマンドを実行してライブプレビューを開始します。次に、インデックスの接頭辞と、画像を保存するファイル保存先を設定します。

次に、RS画像を開始します。CoolSnapカメラの動作設定を指定してください。クロッキングモードは「Normal」に設定してください。

DMDソフトウェアを起動します。スクリプトメニューからダークフィールドアイリスを選択します。次に、ロードしてリセットをクリックします。

スクリプトを手動で実行するには、ビューポート内の顕微鏡オプティブバーをLSMに設定します。これにより、画像がアライメント済みの光学系にあるDMDを介して送信されます。そして、暗視野画像がCascade five 12カメラのCCDに投影されます。

IP labのライブプレビューにダークフィールド像が表示されている必要があります。必要に応じて、ライブプレビューで像のフォーカスを調整してください。画像内の信号強度が少なくとも10,000カウントになるように、露出時間を十分に長く設定します。

次に、「acquire single」コマンドを使用して、視野のスナップショットを撮影します。「save as indexed」コマンドを使用して、画像をディスクに保存してください。GTIの画像によって視野のサイズを測定します。

次に、GTIサンプルを視野外に移動させ、背景のみが見える状態にします。少なくとも5,000カウントを取得するのに十分な露光時間で、その視野の背景画像をキャプチャします。この画像は、フィルター未処理の画像の背景減算に利用されます。

次に、背景のガボールフィルタ処理画像を収集するため、ガボールフィルタバンク（Gabor Filter Bank）スクリプトをDMD制御ソフトウェアにロードします。スクリプト全体を実行し、フィルタをDMDのオンボードメモリにバッファリングしてください。スクリプト全体のバッファリングが完了するまで、数分かかる場合があります。

DMDソフトウェア内のスタートおよびストップマーカーを使用し、1つのGabor Likeフィルターに対応するフィルターセットが一度に1組だけ読み込まれるようにしてください。スクリプトを実行して、背景のフィルタリング画像を収集します。ライブ画像プレビューがダークフィールドからフィルタリング画像に切り替わります。

そのフィルターについて、ディスクからIP labで取得スクリプトを開きます。少なくとも2000カウントが取得されるように、露光時間を調整してください。DMDスクリプトが動作している間に、IP labのライブプレビューをキャンセルし、取得スクリプトを実行します。

これにより、自動的にインデックスを取得し、フィルタリングされた画像がディスクに保存されます。最初の画像が取得されたら、DMDで実行中のスクリプトを停止してください。その後、使用したコマンドをスクリプトから削除してください。

次に、次のフィルターセットの開始および終了マーカーを置き換えます。フィルターバンクをすべて使い切り、すべてのフィルタリング済み画像を取得して保存するまで、IPラボで取得を繰り返します。ラボベンチにハンダごてを接続し、L 15培地を37 °Cに加熱して、細胞の播種準備をしてください。

ペーパータオルとKimwipeを用意してワークステーションを構築し、こぼれた培地を吸収させ、作業領域を清潔に保ちます。Kimwipeをちぎって丸めることで、芯（ウィック）を数本作成します。これらの芯は、セルプレートから液体を吸い出すために使用します。

次に、金属製サンプルホルダーを使用してセルサンドイッチを作成します。シリンジを用いて、加工済み金属プレートの穴の上部外周に沿って真空グリースを薄く塗布し、両側の溝の端の約半分まで伸ばします。きれいな1番カバーガラスを、グリースの上の位置に静かに載せます。

プレートを裏返し、穴の周囲にグリースを塗布します。エタノールで滅菌したNIトライアル試験用手袋を着用し、室内の照明を消します。インキュベーターから細胞を取り出します。

実験に使用するカバーガラスを6ウェルプレートから取り出します。カバーガラスを慎重に乾燥させます。次に、観察孔上のグリースを塗布した金属プレートに、カバーガラスのセル側を下にして押し込みます。

プレート内で細胞を挟み込みます。気泡が残っていないこと、および培地を充填できるようにグリースで水密シールが形成されていることを確認してください。次にプレートを元に戻し、一度に200 µLずつピペッティングします。

あらかじめ温めておいたL 15培地を、上部カバーガラスと金属プレートの間の溝を通して、液面が反対側の溝に届くまでサンドイッチ状の構造体の中に加えます。次に、反対側の溝にウィック（吸水材）を当て、さらに200 µLの培地をピペットでサンドイッチ状の構造体に注入して、細胞を洗浄します。ウィックによって古い培地が除去されることで、培地が一方の側からもう一方の側へと流れます。

このステップでは、液体の中に気泡が形成されないよう注意してください。洗浄ごとに新しい芯を使用して、この工程を2〜3回繰り返します。次に、プレートの端を支えながら、もう一度プレートを反転させ、リザーバー内に液体を閉じ込めます。

はんだごてをveapが入ったビーカーに浸し、veapの一部を素早く溶かして、はんだごての先端に付着させます。はんだごての先端を用いて、溶けたveapをカバースリップ底面の縁に沿って慎重に塗布します。カバースリップの周囲全体に浸漬と塗布を繰り返し、金属プレートに封止します。

これにより良好な機械的シールが形成され、観察中にカバーガラスがプレートから剥がれるのを防ぎます。Kimwipeを丸めてカバーガラスの表面を拭き、底面の残留物を除去してください。

カバーガラスの中央部、すなわち観察領域が最も清潔に保たれるよう、一度のスライド動作で滑り込ませます。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。プレートに入れた細胞を光学室に運び、対物レンズ上にマウントします。

前と同様に、健康そうな細胞が見える視野を探し、その視野の暗視野像を撮影します。次に、顕微鏡をDICに合わせ、露光時間が適切であることを確認してください。その後、カスケードカメラを用いてDIC像を撮影します。

このセットアップでは、顕微鏡をDIC（微分干渉）で調整したまま、cool SNAPカメラを用いて蛍光画像を取得します。顕微鏡のVARを1倍に設定し、ビューポートを100%双眼に設定して、接眼レンズからカメラへ画像を転送します。コンデンサーの上に青色LEDを配置して、視野を照明します。

次に、RSS画像で視野を確認し、微焦点調整を行います。必要に応じてDIC画像を取得し、ディスクに保存します。この視野が、カスケードカメラで得られた視野とどのように異なるかを確認してください。

これらの画像は、実験の解析段階でレジストレーション（位置合わせ）を行う必要があります。次に、蛍光フィルターキューブを所定の位置に移動し、顕微鏡シャッターを用いて短時間だけ蛍光励起を行い、蛍光画像を取得します。取得が完了したら、すぐにシャッターを閉じます。光退色を最小限に抑えるため、蛍光画像はディスクに保存してください。

フィルター処理後の画像を撮影するために、顕微鏡を視野にリセットし、光をLSMポートに送ります。 l前と同様に、細胞がステージ上にあり、かつ視野を乱さない状態で、Gaborフィルターバンクスクリプト全体を実行して、ある一時点のデータ収集を完了させてください。ウィッキング法を用いて、通常のL 15培地を、1 µMのSTS溶液を含む同培地に入れ替えます。

実験の過程で、乾燥を防ぐために追加の培地を補充します。セルプレートをステージから外したり、視野を乱したりすることなく、ピペットでプレートの溝に培地を注入してください。次に、実験が完了するまで、以降の時間点についてこれらの手順を繰り返します。収集したデータには大量のフィルタリング済み画像が含まれており、細胞内構造データを抽出するための処理が必要となります。

ここでは2つの例示的な実験を示します。この図は、海洋ダイアトム藻類のサンプルの連続画像です。配向した特徴がはっきりと確認できます。

暗視野イメージングにおいて。5=0度から5=160度までラベル付けされた光学フィルタ処理後の画像が、サンプルのフィルタ未処理画像と並べて表示されています。比較のため、珪藻の9枚のガボールフィルタ処理画像のセットを、物体の方向についてピクセル単位で処理しました。

各ピクセルにおいて、フィルターの配向方向の関数として、最大信号を平均信号で除し、アスペクト比の値を算出しました。ここで、青色で示される1に近いアスペクト比は、優先的な応答角度が存在しない領域を示しています。赤色で示されるより大きな値は、より高い優先応答角度が存在する領域を示しています。

合計GABORフィルター応答の輝度とコードの有意性は、フィルターの配向を示しており、各ピクセルで最大信号が得られる方向は、基礎となるオブジェクトの配向に対して垂直な方向に対応します。サブストラクチャ粒子の配向はクィバープロットでエンコードされており、各ラインは、フィルター未処理のダークフィールドで可視化された基礎的な局所オブジェクトの配向と密接に一致しています。このクィバープロットは、応答強度が最大値の10%を超えるオブジェクトの配向を示しています。

これらは、生存しているウシ内皮細胞を含む視野の暗視野および光学フィルタ画像であり、アポトーシス誘導剤であるstaurosporineで処理した後、3時間にわたって20分ごとにフィルタ画像を取得しました。ここでは、上段のパネルにアスペクト比マップを、下段のパネルにミトコンドリアの蛍光画像を、時間の関数として示しています。色調は配向度を表しており、これらの時間プロットは、staurosporineで処理した内皮細胞における粒子アスペクト比の配向度の低下を比較したものです。個々のトレースは、単一細胞内での時間プロットを表しています。

ドロップインの配向性は、蛍光領域と一致する細胞領域に限定されています。これで、蛍光による検証が完了しました。これにより、アーカイブ化されます。

したがって、次以降の実験では、蛍光イメージングの手順を省略し、光散乱法を直接用いることでミトコンドリアの測定が可能です。ここでは、Gaborフィルターに基づく光散乱シグネチャを用いて、アポトーシス中のミトコンドリア断片化をモニタリングする方法を説明しました。この手順を行う際は、適切なライフスタイル準備を行い、光学系の光軸調整と校正が適切に完了していることを確認することが重要です。

それでは、UI実験での観察とCoLabの活用について考えていきましょう。