慢性サルモネラ感染マウスモデル

この手順の全体的な目的は、慢性サルモネラ感染マウスモデルを確立することです。まず、サルモネラ溶液を調製します。次に、マウスにストレプトマイシンを経口投与し、続いてサルモネラを投与するか、あるいはストレプトマイシンのみを投与します。

本手順の第3ステップでは、マウスの糞便からサルモネラを分離し、BLクロマプレートを用いてマウス腸管内でのサルモネラ感染を検出します。最終ステップでは、マウスの体重を観察・記録し、サルモネラ感染後の活力の変化を確認します。最終的に、サルモネラを経口投与したマウスの腸管において、サルモネラ感染が成立することが示されます。

こんにちは。私はロチェスター大学医学部のJohnson博士の研究室のMichelle Pです。また、Sun Labからも参加しております。私はSun LabのYです。本日は、Alytic Lennar感染マウスモデルの作製手順について説明します。

当研究室では、宿主と細菌の相互作用におけるシグナル伝達および腫瘍形成を研究するために本手順を用いています。それでは、始めていきましょう。実験を開始する前に、各サルモネラ菌株および実験全体を通して使用するのに十分な量のLuria-Bertani（LB）液体培地またはLB寒天培地プレートを準備してください。

プレートは冷蔵して数ヶ月間保存可能です。次に、サルモネラ培養液を準備します。−80 °Cで凍結保存されたサルモネラのストックバイアルを取り出し、室温で解凍してサルモネラをプレートに塗布します。

白金線路をバーナーで火炎滅菌し、解凍した細菌ストックに浸します。LBプレートの上部3分の1の範囲で、白金線をジグザグに往復させて塗布します。再度白金線を火炎滅菌し、プレートを回転させます。

ループをジグザグに動かして前の画線と交差させ、プレートの2分の1から3分の2の領域に細菌を広げます。これをもう一度繰り返します。その後、再度ループを火炎滅菌します。

ループがアガーに突き刺さらないようにしてください。プレートを37°Cのインキュベーターに一晩保存し、コロニーを成長させます。正しく行われていれば、サルモネラプレートの少なくとも1つのセクションに単一コロニーが形成されます。

翌日。滅菌済みのつまようじまたは白金線を用いてLBプレートからクローンをピックアップし、12 mLチューブに入れた7 mLのLB培地に加えます。チューブを37 °Cで約5時間振盪します。

この培養液を0.05 milliliters使用し、Falconチューブに入れた50 millilitersのLBに接種します。37 °Cで、振盪せずに約18時間インキュベートします。

50 mLの細菌 overnight培養液を室温、5,000 RPMで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、細菌を再懸濁させるため、チューブに1.5 mLのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を加えます（これはLB対HBSSが100:3の比率に相当します）。その後、HBSSを用いて全量を15 mLにします（LB対HBSSの比率を1:10にします）。

マウス1匹あたり、希釈したサルモネラ培養液100 µL（または1×10⁶～1×10⁸ CFU）を必要とします。経口投与を開始する4時間前に、マウスから水と餌を制限してください。次に、7.5 mgのストレプトマイシン粉末を100 µLのHBSSで希釈し、投与直前にストレプトマイシン溶液を調製します。投与時に失われる量を考慮し、注入するマウスごとに十分な余剰量を調製してください。

まず、100 µLのストレプトマイシン溶液を充填した経口投与用針を準備します。経口投与を行うため、ケージから1匹目のマウスを取り出し、ベンチトップの方を向かせて保持します。親指と中指でマウスの肩部分の皮膚をしっかりと掴み、人差し指で頭部と頸部を伸ばして、食道を直線状にします。

給餌針のボールチップを口蓋に沿って、咽頭後壁の右側に向けて進めます。そのまま緩やかに食道内へと挿入し、100 µLのストレプトマイシン溶液を注入します。この際、抵抗が感じられないようにしてください。

実験群および対照群のすべてのマウスに対してこの操作を繰り返します。ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンの経口投与から約20時間後、かつサルモネラ経口投与の4時間前に、サルモネラを投与するマウスの飼料および飲水を制限します。HBSSに調製した100 µLのサルモネラ溶液を用い、前述と同様の方法で各マウスに経口投与します。

経口投与後、各マウスを新しいケージに移し、糞便の採取を開始します。経口投与から約8時間後から、糞便が排出された直後にケージから回収します。実験サンプルとして、マウスの糞便を 100 milligrams 回収します。

糞便中のサルモネラ分析のため、研究期間に応じて毎日または毎週サンプルを採取する。糞便サンプルを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、1 mLのPBSを加え、激しくボルテックスした後、800 RPMで10分間遠心分離する。上清を清潔な1.5 mLチューブに移し、6,000 RPMで5分間遠心分離する。

上清を捨て、200 µLのPBSをペレットに加えてボルテックスで再懸濁します。次に、BB l roagプレートを用いてサルモネラを検出します。糞便溶液を1プレートあたり10～100 µL使用し、セクション2に示されている方法でプレート上に塗布します。

サルモネラ属菌は、特定の発色剤の存在下での代謝の違いにより、赤色を呈します。プレート上のサルモネラコロニー数を計測し、個々のマウス間での感染レベルを比較します。本実験手順では、生後6〜7週のSPF（特定病原体フリー）雌C57BL/6マウスを用いました。

マウスにサルモネラ菌とストレプトマイシン、および HBSS を感染させました。対照群のマウスにはストレプトマイシンのみを経口投与しました。使用したサルモネラ菌株は、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）野生型株 ATCC 14028S FPC、非病原性サルモネラ変異株、および低コピー数プラスミド pSKW 29 に病原性関連遺伝子 AAV R age を保持する James Madera 博士の研究室由来の 3 つの FPC 菌株です。このプロトコルを用いることで、マウスの腸管内におけるサルモネラ・ティフィムリウムの定着を検出できます。

慢性サルモネラ感染は糞便分析によって測定され、免疫蛍光染色のために体重測定および腸管組織サンプルの採取が行われました。通常、感染後4週間以内に体重減少と死亡が発生します。ここでは、感染後4週時点での生存率を示しています。

感染後4週間を生存したマウスは、その後23週間にわたって体重が増加し、死亡率が低下します。全体として、salmonella株（FSY fsy、A VRA null、またはfsy. A VRA ヘテロ接合体）に感染したマウスの65%以上が、腸内にsalmonella感染が持続した状態で6ヶ月以上生存可能です。

急性感染後も、生存個体はサルモネラを保持しており、本プロトコルに記載する方法を用いることで感染6か月後に検出することができました。マウス腸管の組織サンプルを用いた免疫蛍光分析では、感染27週後において腸粘膜へのサルモネラの浸潤が認められます。この画像では、核が青色に、感染したサルモネラが緑色に染色されています。

コントロール群に示されているように、明るい緑色の染色は認められず、これはサルモネラ菌の定着がないことを示しています。一方、感染後27週のサルモネラ感染マウスでは、腸粘膜に明るい緑色の染色が見られます。これは、ストレプトマイシン前処理を施したマウスにおいてサルモネラ感染が持続していることを示しています。

マウスモデルにおける慢性感染の誘導方法について説明しました。この手順を行う際は、接種用に培養物を新鮮に調製すること、適切な接種技術を用いること、そして実験モデルが正しく機能しているかを確認するためにANAの存在を検出することが重要です。以上で説明を終わります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。