真核生物のポリリボソームプロファイル解析

この手順の全体的な目的は、細胞溶解液からモノソーム画分とポリリボソーム画分を分離し、比較することです。これは、まず目的の細胞を培養し、次に細胞溶解液を調製することで達成されます。

手順の3番目のステップは、溶出液をショ糖密度勾配遠心分離にかけることです。手順の最終ステップでは、勾配を分画し、UVトレースによって異なるリボソーム集団を可視化します。最終的に、ポリリボソームプロファイル解析を通じて、異なる実験条件下での翻訳の変化を示す結果を得ることができます。

こんにちは。私はUMDおよびJ Robert Wood Johnson Medical Schoolの分子遺伝学・微生物学・免疫学部、Terry Goss Kinsey博士の研究室のAnthony Espositoです。そして私はMarcus Lewisです。同じくここR-W-J-M-SのKinsey研究室に所属しています。

本日は、ポリリボソーム解析の手順をご紹介します。当研究室では、変異や環境要因によって生じるタンパク質合成の変化を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めましょう。ショ糖。

グラジエントが連続的になるまで時間を置くため、使用前日の1日に調製してください。7%および47%のショ糖ストック溶液を適切な量で混合し、以下の各ショ糖濃度（7%、17%、27%、37%、47%）の溶液を48 mLずつ作成します。各ショ糖溶液に1 M DTTを加え、最終濃度を1 mMにします。グラジエントを注ぐ際は、パスタピペットを20 mLシリンジに取り付け、パラフィルムで固定して密閉してください。

1インチ×3.5インチのポリアマー超遠心管の底部に、7% sucroseを7 mL加えます。次に、パステールピペットのチップをチューブの底付近に配置し、ゆっくりとピペット操作を行うことで、7%溶液の下に17% sucrose溶液を7 mL加えます。各層の注入には、少なくとも20秒以上かけるようにしてください。

勾配が形成されたら、27%、37%および47%のショ糖溶液をそれぞれ7 mLずつ用いて同様に繰り返します。層の間に明確な線が見えれば、混合が最小限に抑えられていることを示しています。作成したすべての勾配を、サンプル回収に使用するローター、ボトル、チューブと共に、4 °Cで一晩保存してください。

酵母細胞から抽出物を調製するには、まず100本の25 mL酵母培養液をOD 600が0.8から1になるまで培養します。培養液にシクロヘキシミドを最終濃度100 µg/mLになるように添加し、30 °Cで15分間振盪を続けます。15分後、培養液を250 mL遠心ボトルに注ぎ、氷で満たします。

これ以降、すべての操作を氷上で行ってください。4°Cで8,000 ×gにて5分間遠心分離します。ペレットを10 mLの氷冷したライシスバッファーで再懸濁し、15 mLポリプロピレンチューブに移します。4°Cで5,900 ×gにて3分間遠心分離し、再懸濁します。

ペレットを0.5 millilitersの溶解緩衝液で懸濁させます。懸濁液を1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、冷却した焼成酸洗浄ガラスビーズを0.5 milliliters加えます。細胞を32分の1秒の間隔で4回ボルテックスし、各間隔の間にはチューブを30秒間氷上で冷却します。

次に、1.5 mLチューブに溶解バッファーをさらに0.5 mL加え、4°Cで5,000 ×gにて5分間遠心分離します。上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、4°Cで最大速度で10分間遠心分離します。

最後に、上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。抽出液は、ショ糖密度勾配にライセートを添加するまで-80°Cで保存可能です。ピペットのチップを、勾配の表面近くのチューブ壁面に当て、ライセートを勾配の上に静かに重ねます。

35 mLのグラジエントに対して、通常500 µLのライセートをロードします。ピンセットを用いて、グラジエントをスイングバケットローターのバケットに慎重に投入します。グラジエントを4 °Cで100,000 ×gにて4時間遠心分離します。

4時間の遠心分離が完了する約30分前に、チューブピアサーに針を取り付け、オンライン吸光・蛍光モニターにペンを装着します。サンプルを分析する前にベースラインが安定するように、吸光モニターの電源を入れておきます。

DI 1 48 Uデータ収集ユニットを接続することで、PolyZoneプロファイルの電子的な取得をリアルタイムで簡単に行うことができます。チャートレコーダーについて、逆流急速設定を用いて、シリンジポンプに50 millilitersのflorin nutsを満たします。気泡が入っていないことを確認してください。

シリンジからのホースをチューブピアサーに接続します。そして、Flo inertを6 mL/minの流量で短時間、正方向に流します。ホース内の気泡を取り除くため、フローセルの末端にあるホースの下に一連のチューブを配置し、サンプルの流出液を回収します。

ショ糖密度勾配を含む遠心管を保持するための、あらかじめ穴を開けた氷バケットを用意します。4時間の遠心分離が完了したら、遠心管を慎重に遠心機ローターから取り出し、氷上に置きます。この際、密度勾配を乱さないように注意してください。

細胞抽出液を分析するために、グラジエントチューブをチューブピアサーにセットし、チューブの上部をアウトレットに接続して固定します。底部ステージを遠心チューブまで上げ、ニードルでチューブの底を貫通させます。Florin alertを順方向に6 mL/minで流し始めます。

液体がチューブに流れ込み始めたら、オンラインUV吸光度モニターの針の動きを監視してください。針が動き始めたら、チャートの走行速度を60に設定して開始します。ポリリボソームプロファイルの終端に達したら、遠心分離チューブへのFlo inertの流れを止め、吸光度蛍光モニターのチャート走行を停止させます。

逆方向に急速にフローを開始させることで、Flo inertを遠心チューブからシリンジ内に回収し、この際、チューブ内のスクロースをシリンジ内に吸い込まないように注意してください。チューブピアサーから遠心チューブを外してねじを緩め、ニードルを下げてチューブを取り出します。ここでは、シクロヘキシミド存在下で酵母から調製したリボソーム抽出物の代表的なトレースを示します。

ポリリボソーム、および60 sおよび40 sリボソームを含むUV吸収ピークが示されています。以上で、ポリリボソーム解析の実施方法について説明しました。この手順を行う際は、迅速に作業し、サンプルを低温に保ち、RNA分解酵素（RNase）を排除することが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。