オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

本実験の全体的な目的は、30日間にわたる一連の培養ステップを経て、胚性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を生成することです。まず、マウスES細胞から胚様体（embryo bodies）を形成させ、細胞分化を誘導します。次に、胚様体を低分子化合物であるレチノイン酸と純粋なモルヒネで処理し、細胞をリガデン（liga den）へと指向性分化させます。

細胞前駆体。第3ステップとして、さらに22日後に胚体を単一細胞へと分散させます。培養細胞の約80%はOPCです。

次に、スパイク発生能を持つOPCを生成するために、NAV 1.2サブユニットを搭載したbaoウイルスをMESC由来OPCに導入します。免疫蛍光顕微鏡観察および電気生理学的記録に基づき、これらのMESC由来OPCにおけるOPCマーカーの発現とスパイク特性を示す結果が得られました。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校細胞生物学・人体解剖学部のDr.Ingの研究室のPong Chiangです。私たちは北カリフォルニア・シュライナーズ小児病院にも所属しています。

こんにちは、Deng研究室のVial Rajです。本日は、マウス胚性幹細胞をグリア前駆細胞へと分化させる手順をご紹介します。当研究室では、より高い治療潜在能を持つ細胞を生成するため、胚性幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞の特性を研究しており、本手順を用いています。

それでは始めましょう。本日は、OG2-GFPマウス胚性幹細胞株からオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を誘導します。これらの胚性幹細胞は、健康な状態を維持し、最適な密度を保ち、また自然分化を防ぐために、3日ごとに継代する必要があります。継代について説明します。

ラミナーフローフード内で、ESS細胞が70%コンフルエンスに達した状態で操作を行います。培養液を除去し、PBSで洗浄した後、あらかじめ温めておいたトリプシンを2mL加えて処理します。

37 °Cで5分間、1回trip LE expressを行います。反応を停止させ、細胞を4 mLのMES細胞培地で再懸濁します。細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、1000 rpmで5分間遠心してペレット化します。

照射済みマウス胚性幹細胞（meth）フィーダー細胞のコンフルエント層上に、MES細胞培地を用いて細胞数の10分の1をMESL培地プレートに再懸濁します。3日後、ES細胞は約70%コンフルエントになり、継代または胚様体形成のための懸濁準備が整います。胚様体を誘導して分化を開始させるため、前述と同様にマウスES細胞コロニーをトリプシン処理し、その後、ノックアウト血清代替物（KSR）またはKSR培地に細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞数を数え、KSR中で懸濁液を希釈します。

15,000 cells/mLに調整した培地を、超低接着6ウェルプレートの各ウェルに3 mLずつ分注して培養します。懸濁細胞を37 °Cで4日間培養してください。2日ごとに培地を完全に交換します。

4日目から、培地を毎日交換します。4日目には、KSRに0.2 µMのレチノイン酸を添加します。5日目には、レチノイン酸と1 µMのプリモルファミンを両方添加し、6日目と7日目にも同様に添加します。胚体（embryo bodies）を、0.2 µMのレチノイン酸と1 µMのプリモルファミンを添加した培地で培養します。培養8日後、大部分の胚体がGFPを発現し、分散可能な状態になります。前述と同様にトリプシン処理を行い、細胞数をカウントします。

その後、細胞を3.5 × 10⁵ cells/mLの密度で再懸濁します。OPC培地を用いて、懸濁液3 mLをOPC培地へ再注入します。ポリオルニシンコートした60 mmディッシュを使用し、約1週間ごとに細胞がコンフルエントになり、このような外観になります。これまでと同様に、3分間のトリプシン処理により細胞を継代します。

最初の再懸濁から30日後。KSR培地において、細胞は発火能を持つOPCを生成するためのオリゴデンドロサイト前駆細胞の特性を示します。コンフルエンシーが50%から70%の間であるマウスESL由来のOPCを使用してください。

培地をXPBSに交換し、細胞を洗浄します。電位依存性ナトリウムチャネル1.2αサブユニットを導入します。

back MAMナトリウムチャネルキットを使用します。1 mLのback MAMコンポーネントAを4 mLの1X PBSと混合します。PBSリンス液を除去し、希釈したコンポーネントを添加します。

37 °Cで2時間インキュベートします。キットの説明に従い、成分BおよびCを添加したOPC培地でバックメモリー剤を置換します。さらに37 °Cで2時間インキュベートします。

インキュベーション後、増強培地を新鮮なOPC培地と交換します。さらに24時間培養した後、この時点でESL由来のOPCのスパイキングをアッセイできます。EBSではGFP蛍光は認められません。

EBSは強いGFP発現を示し、元の再懸濁液からの懸濁後約30日で分散培養が可能な状態になります。KSR培地において、大部分の細胞がNG2染色で免疫陽性となり、これはGFPの発現と一致しています。しかし、脳由来のOPCとは異なり、これらのMES細胞由来OPCは、細胞を0 mVまで脱分極させた場合でも活動電位を発生させることができませんでした。

ウイルス導入によりNAV 1.2サブユニットを導入した後、これらのmES細胞由来OPCは興奮し、活動電位を発生させます。これまで、マウス胚性幹細胞をOPCに分化させ、ウイルス導入によってスパイク発生OPCを生成する方法について説明しました。この手順を行う際は、レチノイン酸、モリフォリン、FGF2を適切に保存し、常に新しい分注液を使用すること、および使用後の余剰なレチノイン酸は廃棄することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。